一、标本的制作

免疫荧光技术在实际应用上主要有直接法和间接法。直接法是在检测样品上直接滴加已知特异性荧光标记的抗血清，经洗涤后在荧光显微镜下观察结果。免疫荧光直接法可清楚地观察抗原并用于定位标记观察。间接法是在检测样品上滴加已知的细菌特异性抗体，待作用后经洗涤，再加入荧光标记的第二抗体。如研制成的抗沙门氏菌荧光抗体，用于750例食品样品的检测，结果表明与常规培养法的符合率基本一致。

在食品卫生检疫中，荧光标记抗体检测标本的制作应力求保持抗原的完整性，并在洗涤和固定过程中不发生溶解或变性。此外，为了便于抗原和抗体接触形成抗原-抗体复合物，以及有利于观察和记录，要求制作的标本尽量薄，对标本中干扰抗原-抗体反应的物质应充分洗涤除去，以免影响标本的观察以及结果的判定。

荧光标记抗体检测标本的制作方法为：①涂片：先将载玻片通过火焰3次，冷却后，挑取被检材料涂布成直径约1cm的圆形涂片，如材料太浓，也可将生理盐水加入被检材料中，混匀后均匀涂片。涂好后，晾干或以电风扇吹干备用；②固定：不同的抗原采用不同的固定剂，一般常用的固定剂为95%～100%乙醇和丙酮，固定的条件温度为37℃、时间为3～15min，某些病毒最好以丙酮在-40～20℃下，固定30min，固定后应随即用PBS反复冲洗，干后即可用于染色。固定的目的是防止标本从玻片上脱落，以及去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。

二、荧光抗体染色方法

1、直接法

直接法是指用特异荧光抗体直接滴加于待检的标本上，由荧光标记的抗体与抗原发生特异结合（图1-1）。标本中如有相应的抗原存在，即与荧光抗体特异性结合，在镜下可见有荧光的抗原复合物。此法的优点是操作简单、特异性高。其缺点是检查每种抗原均需制备相应的特异性荧光抗体，且敏感性低于间接法。       

图1-1　直接法示意图

2、间接法

间接法是根据抗球蛋白试验的原理，用荧光素标记抗球蛋白抗体（简称标记抗抗体）的方法（图2-2）。间接法的检测过程分为两步：第一步，用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上，在湿盒中在37℃下保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体；第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗体。由于结合在抗原-抗体复合物上的荧光素抗体增多，发出的荧光亮度强，因而其敏感性强。此外，它只需制备一种荧光抗体就可以检出多种抗原，能用于检测多种动物的多种抗原-抗体系统，而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体（如麻疹）等的研究和检查。此方法的缺点是易产生非特异性荧光，影响结果判断。

 图2-2　间接法示意图

三、荧光显微镜检查

标本经荧光抗体染色后，需要在荧光显微镜下观察。荧光显微镜是免疫荧光化学的基本工具。它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成，是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。在荧光显微镜检查时，首先要选择好的光源或滤光片，滤光片的正确选择是获得良好荧光观察效果的重要条件。激发滤光片的作用是提供合适的激发光。根据光源和荧光色素的特点，可选用以下三类激发滤板，提供一定波长范围的激发光。紫外光激发滤板：此滤板可使400nm以下的紫外光透过，阻挡400nm以上的可见光通过；紫外蓝光激发滤板：此滤板可使300～450nm范围内的光通过；紫蓝光激发滤板：它可使350～490nm的光通过；最大吸收峰在500nm以上者的荧光素（如罗达明色素）可用蓝绿滤板激发。

荧光显微镜检查的注意事项：①应在暗室中进行检查，进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5～15min，待光源发出的强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本；②防止紫外光对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜；③检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯的发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外光照射3～5min后，荧光也明显减弱；所以，最多不得超过2～3h；④荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源，天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源；⑤标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发；⑥荧光亮度的判断标准：一般分为四级，即“一”——无或可见微弱荧光，“+”——仅能见明确可见的荧光，“++”——可见有明亮的荧光，“+++”——可见耀眼的荧光。

四、免疫荧光技术在食品检验中的应用

食品免疫检测技术是食品分析检测领域的新热点，在残余药物、残余农药、有害微生物等的检测方面取得了显著进展。免疫检测技术是基于抗原-抗体反应的原理对待测物进行定量定性分析的检测方法，具有特异性强、灵敏度高、简便等优点。下文将以红细胞抗体混合荧光抗体染色法对食品中沙门氏菌的检测为例，说明免疫荧光抗体在食品检验中的应用。

1、原理

将抗体球蛋白稀释成2mg/mL，和2%绵羊红细胞1∶1混合（混合后血球成1%），再加依文斯兰2滴（0.1%）。这样的悬液里和血球表面带有沙门氏菌的抗体，加上增菌液，在湿的环境下使抗原和抗体结合，其余的杂质和非特异的物质不与抗体结合，不易固定在玻片上，易被水冲击。因此，有特异性的抗原就能滞留在玻璃片上。

红细胞经过鞣化处理后有一定的吸附作用，能将抗体（包括荧光标记的抗体）吸附在血球上，使血球呈黄绿色（如在荧光血清中加依文斯兰可使血球呈红色），这样在玻璃片上呈现出清晰的背景，镜检时见到血球后可鉴定特异性细菌的存在。因为此法有吸附抗体的作用，所以抗原也不易漏去，这是荧光抗体的优点。

2、方法

（1）取10%戊二醛血球悬液0.3mL于10mL刻度离心管中用2mL生理盐水洗两次（2500r/min，5min）。将沉淀血球配成2%血球悬液，以1∶20000鞣酸生理盐水1∶1混合，置37℃水浴中15min鞣化。

（2）将提纯的伽马球蛋白稀释成2mg/mL，和以上血球1∶1混合。此时血球为1%球蛋白，为1mg/mL。

（3）将以上悬液涂于玻片上（每片8点），在酒精灯上用火焰干燥固定后，加被检的增菌液于涂片点上，37℃湿盒中30min。

（4）冲洗玻片后加沙门氏菌荧光抗血清，37℃，30min在湿盒染色。

（5）洗片：用间接法洗较好，待干后镜检。

3、结果判定

亮度：

#　表示菌形清晰，亮环显著，发闪亮黄绿色荧光。

+++　表示菌形清晰，亮环显著，亮度较强。

++　表示菌形成形，有亮环，亮度较差。

+　表示菌体可有些形态，亮环清楚，荧光微弱。

-　表示无荧光。

菌量：

#　表示视野中菌体密布。

+++　表示视野中菌体较密。

++　表示视野中菌体稀散。

+　表示视野中仅见个别菌体或在数个视野中仅见个别少数菌体。

-表示无典型菌体。

判定：

+　表示阳性。

±　表示可疑，再做第二次染色如仍可疑做常规。

-　表示阴性。