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问题
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序号
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可能原因
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解决方法
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显色淡，灵敏度偏低
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1
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试剂盒未充分平衡
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试剂盒从2～8℃冰箱取出后打开盒盖，于室温平衡至少20分钟，确保所有试剂已平衡至室温（约25℃）
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2
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样品不适合做ELISA检测
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样品一般选择培养上清、血清、血浆。其他样品形式可能不适合做ELISA检测或者需要优化检测的条件（例如稀释液的成分）
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3
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酶标板在贮存或洗后拍干时过分干燥
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防止板过于干燥
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4
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包被抗体遭到破坏
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操作温和，移液枪不能碰到孔底
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5
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样本和抗体孵育条件不合适
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按照说明书条件，建议孵育过程中全程振荡孵育。
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6
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洗涤浸泡时间过长
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按照说明书操作。勿人为增加浸泡时间；
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7
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偶联HRP试剂污染
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弃去试剂，重新配置
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8
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错误的稀释偶联HRP试剂
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弃去试剂，重新配置
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9
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TMB底物孵育时间过短，因非人为因素影响，需要优化孵育时间
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确定合适的孵育时间：人为判定-最高浓度的标准品出现深蓝色；S4-5有淡蓝色；机器判定620 nm波长下测定OD值达到0.6-0.65
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10
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样本浓度过高或存在基质效应
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按照说明书稀释倍数。
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11
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酶标仪滤光片设置有问题或者波长选择不对
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确认仪器设置及选择正确的波长检测。
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12
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酶标板不适合做ELISA
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不能使用细胞培养板，建议使用ELISA专用高吸附力板子。
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背景深，全部呈有色（通常的Elisa背景值OD<0.2）
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1
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洗涤不充分，洗后未拍干，样品中其它成分残留或酶标记物残留
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洗液准确配制；充分洗涤，静置15秒，彻底拍干。加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用，不要反复使用，否则易造成污染。
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2
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底物污染，未避光保存，出现颜色
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弃去底物，重新配置
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3
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样品稀释液污染
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弃去稀释液，重新配置
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4
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吸头重复使用，未洗净或消毒不彻底
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吸头尽可能一次性使用
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5
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不正确的孵育时间，温度（尤其是底物孵育的时间）
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最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。完全按照说明书要求。
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6
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偶联抗体（streptavidin-HRP）浓度过高
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按照说明书调整到最佳的浓度
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7
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ELISA板子不正确的贮存
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酶标板贮存于2-8 ℃；使用结合力低点的Elisa板
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8
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没有正确封闭
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在标准品稀释液中加入动物蛋白或延长封闭时间
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9
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样本溶血严重
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建议使用非溶血或轻微溶血样本，严重溶血样本会导致背景偏高。
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重复性不佳，高CV值
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1
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样品不均一
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加样前充分混匀样品，取样确保移液位置一致；
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2
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包被板表面遭到破坏
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洗板加样时尽量小心，避免破坏板的包被表面
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3
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孔与孔之间的交叉污染
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孵育后取下盖子小心操作，避免孔与孔的污染；封板膜不能重复使用
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4
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加样量不一致
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样品稀释前应充分混匀，尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴
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5
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边缘效应（外周孔显色较中心孔深）
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孵育时尽量100 rpm旋转混匀
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6
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微量加样不准确
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保证微量加样的准确性和均一性
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7
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不正确的洗涤
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洗液准确配制；充分洗涤，静置15秒，确定每一步的洗涤
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出现白板，阳性对照不显色
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1
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显色液变质
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更换新的显色液
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2
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洗涤液配制有误
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请按说明书所示稀释倍数配制
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3
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未加酶结合物而认为已加入
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注意不要漏加
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4
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终止液误作洗涤液稀释或当底物液使用
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每次加液前均应看清标签
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5
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标准品稀释方法错误/或标准品有问题
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请按照说明书所示配置说明书，注意单位和稀释倍数
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6
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不同试剂盒或不同批号的试剂混用
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建议使用同批次试剂盒。不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂。
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不正常的标准曲线
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1
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错误的方法重悬标准品
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加入正确量的溶液重悬标准品，重悬充分
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2
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标准品稀释错误
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按照说明书要求稀释标准品
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3
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标准品污染
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使用一次性的灭菌吸头， 标准品贮存于2-8 ℃
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4
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错误的倍比稀释步骤
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按照说明书倍比稀释标准品
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5
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波长选择错误
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TMB为底物和以OPD为底物的试剂盒均有使用，而 前者比色波长为450nm，后者为492nm。双波长比色分析优于单波长。
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6
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标准品混用
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不同批号试剂勿混用
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7
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试剂盒在运输途中时间太长，温度太高，标准品失活
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尽量缩短运输时间，夏季应放冰块降温
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8
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ELISA未终止而直接检测450nm和620nm
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TMB显色需终止后检测，否则会出现620nm比450nm读数高的现象。（数值仍有梯度规律）
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样品或标准品OD超出正常范围
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1
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错误的样品或标准品的稀释
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完全按照说明书稀释
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2
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偶联抗体浓度过高
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按照说明书调整到最佳的浓度
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3
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TMB底物孵育时间过长
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调整到合适的孵育时间
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4
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样品或标准品污染
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避免污染
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5
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错误的孵育时间或温度
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完全按照说明书
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6
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孵育时未加盖导致溶液挥发和污染
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贴封片或加盖
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标曲很好，但是样本无法计算到数值
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1
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标曲选择不合适
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选择最合适的标曲拟合；
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2
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样本含量很低，低于灵敏度无法被检测到
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尝试浓缩样本或使用高敏ELISA试剂盒检测
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3
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样本含量很高，超过标曲
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建议进行预实验摸索稀释倍数，确保样本OD值落在标曲范围内
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标曲高浓度间无明显趋势
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1
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如OD绝对值靠谱，但是仅无梯度，则显色过度
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TMB显色体系中建议根据S1，S2颜色进行判断，当S1，S2深蓝色，有明显梯度，S5有淡蓝色时即可终止。
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2
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仅作单波长检测。
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由于参考波长读取非特异性检测，如指纹、划痕、水渍等，对结果也有影响。建议最终结果以双波长为最准确。
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