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　　华远带您了解，琼脂糖凝胶制备的操作步骤

　　1、取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml，配制成0.5×TBE稀释缓冲液，待用。

　　2、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液，放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为0.8%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发。

　　3、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。

　　向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg /ml(也可不把EB加入凝胶中，而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起，阻碍缓冲液进入样品槽中，所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。

　　4、加样：取10μl酶解液与2μl 6×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

　　5、电泳：加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。

　　6、染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml的EB溶液中，室温下染色20-25分钟。

　　7、观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩，以免损伤眼睛。 经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上，采用全色胶片，光圈5.6，曝光时间10-120秒(根据荧光条带的深浅选择)。

　　8、DNA分子量标准曲线的制作：在放大的电泳照片上，以样品槽为起点，用卡尺测量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的迁移距离，以厘米为单位。以核苷酸数的常用对数为纵坐标，以迁移距离为横坐标，在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线，即为该电泳条件下DNA分子量的标准曲线。

　　9、DNA酶切片段大小的测定：在放大的电泳照片上，用卡尺量出DNA样品各片段的迁移距离，根据此数值，在DNA分子量标准曲线上查出相应的对数值，进一步计算出各片段的分子量大小(若用单对数坐标纸来绘制标准曲线，则可根据迁移距离直接查出DNA片段的大小)。反之，若已知DNA片段的大小亦可由标准曲线上查出它预计的迁移距离。

　　10、DNA酶切片段排列顺序的确定：根据单酶切，双酶切和多酶切的电泳分析结果，对照DNA酶切片段大小的数据进行逻辑推理，然后确定各酶切片段的排列顺序和各酶切位点的相对位置。以环状图或直线图表示，即成该DNA分子的限制性内切酶图谱。

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