石蜡切片荧光tunel+IF实验报告
一、实验器材及试剂
- 实验器材
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名称 |
厂家 |
型号 |
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脱水机 |
武汉俊杰电子有限公司 |
JJ-12J |
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包埋机 |
武汉俊杰电子有限公司 |
JB-P5 |
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病理切片机 |
上海徕卡仪器有限公司 |
RM2016 |
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冻台 |
武汉俊杰电子有限公司 |
JB-L5 |
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组织摊片机 |
浙江省金华市科迪仪器设备有限公司 |
KD-P |
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烤箱 |
上海慧泰仪器制造有限公司 |
DHG-9140A |
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载玻片 |
Servicebio |
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盖玻片 |
江苏世泰实验器材有限公司 |
10212432C |
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脱色摇床 |
Servicebio |
TSY-B |
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涡旋混合器 |
Servicebio |
MX-F |
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掌上离心机 |
Servicebio |
D1008E |
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移液枪 |
Dragon |
KE0003087/KA0056573 |
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组化笔 |
Gene tech |
GT1001 |
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正置荧光显微镜 |
日本尼康 |
Nikon Eclipse C1 |
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成像系统 |
日本尼康 |
Nikon DS-U3 |
- 主要实验试剂
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试剂 |
厂家 |
货号 |
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无水乙醇 |
国药集团化学试剂有限公司 |
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二甲苯 |
国药集团化学试剂有限公司 |
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PBS缓冲液 |
Servicebio |
G0002 |
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破膜液 |
Servicebio |
G1204 |
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蛋白酶K |
Servicebio |
G1205 |
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BSA |
Servicebio |
G5001 |
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Tunel试剂盒 |
Servicebio |
G1501 |
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一抗 |
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荧光二抗 |
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DAPI |
Servicebio |
G1012 |
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抗荧光淬灭封片剂 |
Servicebio |
G1401 |
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- 石蜡切片荧光tunel+荧光实验步骤
- 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15-20min-二甲苯Ⅱ15-20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗（冬天脱蜡时间稍微延长）。
- 修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复缓冲液（PH6.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火8min停火8min中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复条件根据组织来确定）
- 加蛋白酶K：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液覆盖组织，37度温箱孵育25min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
- 加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT) 和试剂2(dUTP)按1:9混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温箱孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
- BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
- 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）
- 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
- DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
- 封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
- 镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发红光
三．石蜡切片荧光tunel+IF结果判读
DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，tunel试剂盒为FITC荧光素标记，阳性凋亡细胞为绿光，一抗标记为红色。
