WB检测细胞因子表达

一、所用抗体信息：

二、主要试剂与耗材

全蛋白抽提试剂盒（安徽华远经济发展有限公司）

BCA蛋白含量检测试剂盒（安徽华远经济发展有限公司   ）

SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（安徽华远经济发展有限公司   ）

预染蛋白分子量（安徽华远经济发展有限公司   ）

5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（安徽华远经济发展有限公司   ）

1×Tris-甘氨酸蛋白电泳缓冲液（安徽华远经济发展有限公司）

Western Blotting检测试剂盒（安徽华远经济发展有限公司）

显影定影试剂（安徽华远经济发展有限公司）

三、主要仪器与设备

电泳仪（美国 Bio-rad Power Supplies Basic）

Trans-Blot Turbo全能型蛋白转印系统（美国 Bio-rad  170-4150）

凝胶成像系统（英国 SYNGENE G:BOXChemiXR5）

台式恒温振荡器（中国 上海精宏实验设备有限公司 THZ-312）

涡旋振荡器（中国 海门其林贝尔 XW-80A）

高速冷冻离心机（美国 Thermo Sorvall ST 16R）

多功能酶标仪（美国 MD Spectramac M3）

PH计（美国 OHAUS STARTER 2C）

分析天平（中国 精密分析天平 JA3003）

移液器（德国 eppendorf  2.5/10/200/1000μL）

四、实验方法

1.配置Western 所需的全部溶液

1. 1.5M Tris，PH 8.8

Tris Base   18.16g

双蒸水     80ml

溶解后，浓盐酸调PH至8.8，定容至100ml，4℃保存。

2. 0.5M Tris，PH 6.8

Tris Base   18.16g

双蒸水     80ml

溶解后，浓盐酸调PH至6.8，定容至100ml，4℃保存。

3.10%AP（过硫酸铵）

AP    1g

双蒸水 10ml

溶解后，分装冻存。

4. 10* Running buffer

Tris      30g

甘氨酸  144g

SDS     10g

去离子水定容至1000ml。4℃保存。

使用时：取100ml，加入900ml去离子水，充分混匀。

5. 10*Trans buffer

     甘氨酸  144g

      Tris     30g

     去离子水定容至1000ml

  使用时：10* Trans buffer   100ml

           甲醇            200ml

          去离子水定容至  1000ml

现用现配。 

6.  10*TBS  

        Tris   24.2g

        Nacl   80g

        双蒸水定容  1000ml

7. TBS-T

        10*TBS   100ml

         Tween 20  1ml

      双蒸水定容  1000ml

8.封闭液

         脱脂奶粉    5.0g

         TBS-T      100ml

2. 蛋白样客户提供。

      浓缩胶10%，分离胶5%。上样10ml。

电泳：

 浓缩胶 60V 30min；

      分离胶 120V 60min 直至溴酚蓝跑到底端。

上样顺序：

见结果分析。

湿转： 

110V 90min

      转膜的顺序：固定盒打开，黑色一面向下：从下到上依次是：纤维垫，滤纸，胶，PVDF膜（左上角剪角做标记），滤纸，纤维垫。玻璃棒挤压空气。整个系统置于冰盒内。

封闭：

5%脱脂奶粉，室温条件，封闭2h。现用现配（TBS-T稀释）。

孵育一抗：

取抗体10ml，新配的TBS-T稀释至10.0ml，置于parafilm封口膜上（注意PVDF膜的正反面），4℃孵育过夜。

内参：取抗体2 ml，新配的TBS-T稀释至20.0ml，置于parafilm封口膜上（注意PVDF膜的正反面），4℃孵育过夜。

孵育二抗：

TBS-T洗涤六次，每次10min；羊抗兔HRP（武汉博士德，1：1000）取抗体1 ml，新配的TBS-T稀释至1ml，置于parafilm封口膜上（注意PVDF膜的正反面），室温孵育2h。

显色：

TBS-T洗涤三次，每次10min。ECL显色液（millipor）溶液A 0.5ml 溶液B 0.5ml。混合均匀后显色。凝胶成像，蛋白质印迹成像和定量分析系统(Quantitative Gel and Western Blot Imaging System)（型号： FluorChem Q）显色，曝光。