标签：免疫试剂 华远化学 生物制剂 细胞裂解液 单克隆抗体
华远阐述：免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤
注意：在准备做磷酸(酯)酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂
工作液配制：
配制100ml的modified RIPA buffe：
1. 称取790mg 的Tris-Base，加到75ml 去离子水中，加入900mg的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.4
2. 加10 ml 10%的NP-40
3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清
4. 加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存
5. 理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 μl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 μl)，但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。
各种成分在工作液中的终浓度：
* Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4
* NP-40: 1%
* 去氧胆酸钠：0.25%
* NaCl: 150 mM
* EDTA: 1 mM
* PMSF: 1 mM
* 抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 μg/ml
* Na3VO4: 1 mM
* NaF: 1 mM
三、实验流程为：
(1)转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C，最大转速离心30 min后取上清;
(2)取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜;
(3)取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min;
(4)将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;
(5)免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟;
(6)SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。通过免疫共沉淀确定结合蛋白
1.用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。
2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。
3.收集上清(约30 ml)并加入30μg的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1 h。
4.加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液，4℃摇动免疫沉淀物30 min。
5.用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次。最后，用NETN洗一次。
6.吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4 min。
7.将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10 mA的恒定电流下电泳过夜。
8.通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。
9.从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml 50%乙腈洗两次，每次3 min。
10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。
11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。
四、注意的问题：
(1)细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂(NP40 或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的 cocktailer。
(2)使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用
(3)使用对照抗体：
单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗
兔多克隆抗体：正常兔IgG
在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性，应注意以下几点：
(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;
(2) 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;
(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。
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