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　　超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)试剂盒说明书(WST-8法)分光光度法

　　正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

　　测定意义：

　　SOD(EC 1.15.1.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化超氧化物阴离子发生岐化作用，生成H2O2和O2。SOD不仅是超氧化物阴离子清除酶，也是H2O2主要生成酶，在生物抗氧化系统中具有重要作用。

　　测定原理：

　　通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O2-.)，O2-.可与WST-8反应产生水溶性染料甲臜，后者在450nm处有吸收;SOD可清除O2-.，从而抑制了甲臜的形成;反应液黄色越深，说明SOD活性愈低，反之活性越高。

组成：

　　自备仪器和用品：

　　分光光度计、离心机、移液器、1ml玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水

　　粗酶液提取：

　　1、细菌、细胞或组织样品的制备：

　　细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个)：提取液体积(ml)为500~1000：1的比例(建议500万细菌或细胞加入1ml提取液)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次);8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

　　组织：按照组织质量(g)：提取液体积(ml)为1：5~10的比例(建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液)，进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

　　2、血清(浆)样品：直接检测。

　　超氧化物歧化酶试剂盒测定步骤：

　　1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至450nm，蒸馏水调零。

　　2、 试剂三的稀释：将试剂三用蒸馏水稀释50倍，用多少配多少。(试剂三和蒸馏水1：49稀释。

　　3、 工作液配制：在试剂一加入250μl试剂二，充分混匀。配好的试剂4℃避光可保存一周。(若一次性测定样本较少，可按照实际用量将试剂一和试剂二按照20ml：0.1ml的比例混匀配制)

　　4、 将一瓶试剂四用5ml蒸馏水溶解(溶解后一周内用完)。

　　5、 样本测定(在1ml玻璃比色皿中依次加入下列试剂)

　　充分混匀，室温静置30min后，450nm处测定各管吸光值A。

　　超氧化物歧化酶试剂盒注意事项:

　　1、试剂三为酶，不可冷冻，使用时在冰上放置。

　　2、对照管只需要做一管。

　　3、SOD为什么有的样本测定管大于对照管，对照管数值在什么范围?

　　对照管的范围是0.8-2。对照管吸光值过低可能是(1)试剂三活性低，可以适当减少稀释倍数;(2)没有按顺序加试剂;(3)反应时间不够，可以延长反应时间(反应时间30min可以延长到40min)。对照管吸光值过高可能是试剂三未按操作说明书稀释相应倍数。

　　若出现测定管大于对照管，可能是样本中杂质的影响太大，为了降低杂质的影响一般将样本提取上清液用蒸馏水或提取液稀释10倍后再测，通常可以使测定正常。计算公式中乘以相应稀释倍数。

　　SOD活性计算：

　　1、抑制百分率的计算

　　抑制百分率=(A对照管-A测定管) ÷A对照管× 100%

　　尽量使样本的抑制百分率在10-90%范围内。如果计算出来的抑制百分率小于10%或大于90%，则通常需要调整加样量后重新测定。如果测定出来的抑制百分率偏高，则需将样本用提取液适当稀释;如果测定出来的抑制百分率偏低，则需重新准备浓度比较高的待测样本。

　　2、SOD酶活性单位：在上述黄嘌呤氧化酶藕联反应体系中抑制百分率为50%时，反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位(U/ml)。

　　3、SOD酶活性计算：

　　(1)血清(浆)SOD活性(U/ml)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反总]÷V样

　　=20×抑制百分率÷(1-抑制百分率)

　　(2)组织、细菌或培养细胞SOD活力计算：

　　a.按样本蛋白浓度计算

　　SOD活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反总]÷(V样×Cpr) =20×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷Cpr需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。

　　b.按样本鲜重计算

　　SOD活性(U/g 鲜重)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反总]÷(W ×V样÷V样总) =20×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷W

　　c.按细菌或细胞个数计算

　　SOD活力(U/104 cell)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率) ×V反总]÷(500×V样÷V样总) =0.04×抑制百分率÷(1-抑制百分率)

　　V反总：反应体系总体积，1ml;V样：加入反应体系中样本体积，0.05ml;V样总：加入提取液体积，1 ml;Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml ;W：样本质量，g;500：细胞或细菌总数，500万。

　　超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)试剂盒说明书(WST-8法)分光光度法 华远公司主要业务为向大专院校、科研机构，药企、化工企业提供高品质、特殊规格的化学产品和技术解决方案，已经形成了累计服务超过1000家客户，提供高规格产品超过6000种，合作行业和产业伙伴超过1200家的体量和规模，积累了丰富的经验和良好的口碑。基于长期的行业经验和积累，我司已经形成了既能满足研发类客户对产品种类、包装、纯度的特殊要求，也能适应企业从小试、中试到规模化等各个阶段的综合需求的核心能力。公司在技术理念、产品研发、产品合成、产品分析、质量检测、产品存储、产品包装等相关领域，都形成了相对成熟领先的自有体系。