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　　PCR实验常见问题及其解决方案

　　PCR产物的电泳检测时间，一般为48h以内，有些最-好于当日进行检查，大于48h后带型不规则甚至消失。

　　但有时仍会与到这样那样的问题，影响检测结果的判断，具体归类为以下常见的4点，华远技术描述如下：

　　问题一：无扩增产物

　　现象：正对照有条带，而样品则无。

　　原因：

　　1、模板:含有抑制物，含量低。

　　2、Buffer对样品不合适。

　　3、引物设计不当或者发生降解。

　　4、反应条件：退火温度太高，延伸时间太短。

　　对策：

　　1、纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量。

　　2、更换Buffer或调整浓度。

　　3、重新设计引物(避免链间二聚体和链内二级结构)或者换一管新引物。

　　4、降低退火温度、延长延伸时间。

　　问题二：非特异性扩增

　　现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带。

　　原因：

　　1、引物特异性差。

　　2、模板或引物浓度过高。

　　3、酶量过多。

　　4、Mg2+浓度偏高。

　　5、退火温度偏低。

　　6、循环次数过多。

　　对策：

　　1、重新设计引物或者使用巢式PCR。

　　2、适当降低模板或引物浓度。

　　3、适当减少酶量。

　　4、降低镁离子浓度。

　　5、适当提高退火温度或使用二阶段温度法。

　　6、减少循环次数。

　　问题三：拖尾

　　现象：产物在凝胶上呈Smear状态。

　　原因：

　　1、模板不纯。

　　2、Buffer不合适。

　　3、退火温度偏低。

　　4、酶量过多。

　　5、dNTP、Mg 2+浓度偏高。

　　6、循环次数过多。

　　对策：

　　1、纯化模板。

　　2、更换Buffer。

　　3、适当提高退火温度。

　　4、适量用酶。

　　5、适当降低dNTP和镁离子的浓度。

　　6、减少循环次数。

　　问题四：假阳性

　　现象：空白对照出现目的扩增产物。

　　原因：

　　靶序列或扩增产物的交叉污染。

　　对策：

　　1、操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

　　2、除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。

　　3、各种试剂最-好先进行分装，然后低温贮存。

　　PCR实验常见问题及其解决方案 华远化学公司主要业务为向大专院校、科研机构，药企、化工企业提供高品质、特殊规格的化学产品和技术解决方案，已经形成了累计服务超过1000家客户，提供高规格产品超过6000种，合作行业和产业伙伴超过1200家的体量和规模，积累了丰富的经验和良好的口碑。基于长期的行业经验和积累，我司已经形成了既能满足研发类客户对产品种类、包装、纯度的特殊要求，也能适应企业从小试、中试到规模化等各个阶段的综合需求的核心能力