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酰基转移酶(alcohol acyl transferase，AAT)活性测定试剂盒说明书
正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
AAT是一个多功能蛋白大家族，主要负责催化生物体内各种酰基化和去酰基化反应，在基因表达、代谢和信号传导中具有重要作用。
测定原理：
AAT催化乙酰CoA转移乙酰基到丁醇，释放的CoA还原DTNB生成TNB;TNB在412nm有吸收峰，测定412 nm吸光度增加速率可计算AAT活性。
自备仪器和用品：
研钵、冰、台式离心机、可见分光光度计、1ml玻璃比色皿、恒温水浴锅、无水乙醇。
粗酶液提取：
1. 组织：按照组织质量(g)：提取液体积(ml)为1：5~10的比例(建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液)进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量(104个)：提取液体积(ml)为500~1000：1的比例(建议500万细胞加入1ml提取液)，冰浴超声波破碎细胞(功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min);然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3. 液体：直接检测。
FA005-25T/24S-AAT测定操作：
1、分光光度计预热30min，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。
2、工作液的配制：临用前在试剂二瓶中加入22.5mL试剂一，充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
3、试剂三的配制：临用前加无水乙醇1.25mL充分溶解待用，用不完的试剂4℃保存。
4、空白管：在Ep管或96孔板中加入50μl提取液和900μL工作液，充分混匀，35℃反应15min，加入50μL试剂三，充分混匀，25℃静置10min，测定412nm处吸光值，记为A空白管。
5、测定管：在Ep管或96孔板中加入50μl样本和900μL工作液，充分混匀，35℃反应15min，加入50μL试剂三，充分混匀，25℃静置10min，测定412nm处吸光值，记为A测定管。△A=A测定管- A空白管，空白管只要做一管。
FA005-50T/48S-AAT测定操作：
1、分光光度计预热30min，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。
2、工作液的配制：临用前在试剂二瓶中加入45ml试剂一，充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
3、试剂三的配制：临用前加无水乙醇2.5ml充分溶解待用，用不完的试剂4℃保存。
4、空白管：在Ep管或96孔板中加入50μl提取液和900μl工作液，充分混匀，35℃反应15min，加入50μl试剂三，充分混匀，25℃静置10min，测定412nm处吸光值，记为A空白管。
5、测定管：在Ep管或96孔板中加入50μl样本和900μl工作液，充分混匀，35℃反应15min，加入50μl试剂三，充分混匀，25℃静置10min，测定412nm处吸光值，记为A测定管。△A=A测定管- A空白管，空白管只要做一管。
AAT活性计算公式：
(1)按照蛋白浓度计算
活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活单位。
AAT (nmol/min /mg prot) = △A ÷(×d)×V反总÷(V样×Cpr)÷T = 98.04×△A÷Cpr
(2)按照样本质量计算
活性单位定义：每克组织每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活单位。AAT (nmol/min /g 鲜重) = △A ÷(×d)×V反总÷(W×V样÷V样总) ÷T =98.04×△A÷W
(3)按细胞数量计算
活性单位定义：每104个细胞每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活单位。
AAT (nmol/min /104cell) = △A ÷(×d)×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总) ÷T=98.04×△A÷ 细胞数量
(4)按液体体积计算
活性单位定义：每毫升样品每分钟催化产生1nmol TNB定义为一个酶活单位。
AAT (nmol/min /ml) = △A ÷(×d)×V反总÷V样÷T =98.04×△A：TNB消光系数，13600L/mol/cm;V反总：反应总体积，1ml;V样：加入反应体系中上清液体积，0.05ml;V样总：加入提取液体积，1ml;Cpr：蛋白含量，mg/ml;W：样本质量，g;T：反应时间，15 min。
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