血清制备/ELISA @华远新闻

  血清制备

  1.取血后，37oC下，让血液凝固1到2小时（不加抗凝剂）；

  2.4oC冰箱过夜（让血块固缩）；

  3.当血清自然析出后，4oC，3000转/分，离心10分钟，分离血清，弃去不溶物；

  4.将血清移至一干净试管，并分装成小份，储藏在-80oC。

  ELISA

  一、包被抗原

  1.用50mM的碳酸盐包被缓冲液（pH 9.6）溶解抗原，使抗原浓度为10-20μg/ml，加100μl/孔到96孔酶标板，4 oC放置过夜。

  2.第二天弃去包被液后，用PBST洗涤3次，每孔加入150μl 1％BSA 37 oC封闭1小时。

  3.PBST洗涤3次后，每孔加入100μl不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37 oC孵育2小时。

  4.PBST洗涤5次后，加入100μl稀释后的HRP标记的二抗，37 oC孵育1小时。

  5.PBST洗涤5次后，显色剂显色20 min后，酶标仪上读取A405吸收值。

  二、包被细胞

  1.在96孔培养板上接种细胞数为1 x 104 cells/well，37℃过夜培养。

  2.第二天用PBS洗涤培养板2-3次。

  3.加入125?l/well 10%Formalin（1:10稀释）,室温下固定15 min。

  4.用ddH2O洗涤培养板3次，并晾干，储藏在2-8oC备用。

  5.用PBST洗涤3次，每孔加入150μl 1％BSA 37 oC封闭1小时。

  6.PBST洗涤3次后，每孔加入100μl不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37 oC孵育2小时。

  7.PBST洗涤5次后，加入100μl稀释后的HRP标记的二抗,37 oC孵育1小时。

  8.PBST洗涤5次后，显色剂显色20 min后，酶标仪上读取A405吸收值。50mM的碳酸盐包被缓冲液：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4℃，保存,Na2CO3 0.15克,NaHCO3 0.293克,蒸馏水稀释至100 ml。ABTS作为底物进行显色反应(10ml)：

  0.2M

  Na2HPO4

  2.4ml

  0.1M

  柠檬酸2.6ml

  ddH2O

  5ml

  ABTS

  5mg

  H2O2(30%)

  4ul（用前加入）

  注意：

  一般做倍比稀释进行检测，需要有相应的对照血清。

  不同的显色系统对应不同的光吸收值。

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