Western Blot样品的处理方式 华远新闻√

　　1.培养的细胞(定性)：

　　(1)去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍(冷的PBS有可能使细胞脱落)。

　　(2)对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。

　　(3)100℃，1min。

　　(4)用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex2~3次。

　　(5)用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP管置于0℃后在14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。

　　(6)待样品恢复到室温后上样。

　　2.培养的细胞(定量)：

　　(1)去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍(冷的PBS有可能使细胞脱落)。

　　(2)加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。

　　(3)用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声(100~200w)3s，2次。

　　(4)12000g离心，4℃，2min。

　　(5)取少量上清进行定量。

　　(6)将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样，剩余溶液(溶于1×loading buffer)可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。

　　3.组织：

　　(1)匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温，快速匀浆。

　　(2)12000g离心，4℃，2min。

　　(3)取少量上清进行定量。

　　(4)将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样，剩余溶液(溶于1×loading buffer)可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。

　　(裂解液配方：Tris-Cl(pH7.4)20mM，EDTA1mM由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO40.1mM及NaF25mM)。

　　(1×loading buffer配方：10%甘油，50mMTris·Cl(pH6.8)，2%β-巯基乙醇，0.2~0.5‰溴酚蓝，2%或5%的SDS。Buffer可配成2×~5×，注意SDS终浓度勿超过10%。对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS，肝肾等组织2%即可。)

　　Western Blot样品的处理方式 华远公司主要业务为向大专院校、科研机构，药企、化工企业提供高品质、特殊规格的化学产品和技术解决方案，已经形成了累计服务超过1000家客户，提供高规格产品超过6000种，合作行业和产业伙伴超过1200家的体量和规模，积累了丰富的经验和良好的口碑。基于长期的行业经验和积累，我司已经形成了既能满足研发类客户对产品种类、包装、纯度的特殊要求，也能适应企业从小试、中试到规模化等各个阶段的综合需求的核心能力。