基因甲基化特异性PCR扩增(MSP)试剂盒产品说明书

　　主要用途

　　基因甲基化特异性PCR扩增(MSP)试剂盒是一种旨在通过设计符合胞嘧啶转化的特殊引物，对转化基因组的CpG岛区域进行PCR扩增，探测基因甲基化信息的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。可以被用于父母印记、X染色体研究、肿瘤抑制基因等表观遗传学研究。产品即到即用，性能稳定，操作简便，扩增效率显著。

　　技术背景

　　在基因的启动子区域(promotor region)通常存在一些富含重复双核苷酸“"的区域，称为“岛"( island)。在人类基因组内，存在有近3万个岛。这些岛不仅是基因的一种标志，而且还参与基因表达的调控和影响染色质的结构，更是DNA甲基化的位置。岛甲基化形态的扫描分析是基因表达和表观基因组学的主要课题。

　　基因甲基化特异性PCR扩增 保存方式

　　保存在-20℃冰箱里;有效保证6月

　　用户自备

　　转化样品：经过亚硫酸盐转化的目标DNA分子

　　特异引物：用于甲基化基因扩增的引导DNA分子

　　PCR仪：用于样品扩增

　　PCR管或平板：用于PCR反应的容器

　　基因甲基化特异性PCR扩增实验步骤

　　实验开始前，从-20℃冰箱中取出试剂，放进冰槽里融化。然后进行下列操作：

　　1.针对一个样本，每次移出15微升扩增液(Reagent A)到PCR管

　　2.加入1微升用户自备的的转化或野生型DNA样品(总量100纳克)

　　3.分别加入1微升用户自备的甲基化特异性的引物F和引物R(各350纳克或25微摩尔)

　　4.再加入7微升补充液(Reagent B)(反应总量为25微升)

　　5.即刻放进微型台式离心机瞬时离心5秒，速度为500g(或2000RPM;例如eppendorf 5415)

　　6.加入50微升PCR级矿物油(注意：参见注意事项10)

　　7.即刻进行热启动PCR反应：

　　基因甲基化特异性PCR扩增注意事项

　　1.本产品为60次操作

　　2.操作时，须戴手套

　　3.建议使用带滤芯的枪头，避免污染

　　4.转化后的DNA样本须保存在-20℃冰箱里，否则容易降解;同时尽快进行扩增等后续操作

　　5.一个特定基因的甲基化检测通常包括转化、PCR和直接测序三步。PCR用于筛选和定位，可以发现0.1%甲基化;测序是精确定位，是分析金标准

　　6.一个特定基因的甲基化特异性PCR通常包括三组PCR： 野生型(W)、转化后甲基型(M)、转化后非甲基型(U)

　　7.甲基化特异性PCR的引物设计原则：引物以SENSE的DNA链为模板;引物含有足够多的C(后面不和G相连);引物含有1-3个位点;位点须在3端;PCR片段长度在80-250碱基;三组引物取自同一位点，通过长度变化获得相同的Tm，并在电泳上有所区别。

　　8.直接测序的引物设计原则是：引物不能含有CPG位点;引物含有足够多的C(不和G相连);采用巢式引物

　　9.基因甲基化区域选择原则：如果是一个检测的基因，首先，选择启动子部位;第二，选择足够多的CPG位点;第三、 选择200碱基以上区域，且GC超过50%

　　10.通过1.8%琼脂糖凝胶或15%聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测PCR扩增后的结果。假如DNA样品在修饰前是未甲基化的，那么仅仅“U"Primers将产生扩增产物;相反，已甲基化的DNA样品仅仅用“M"Primer能被扩增

　　11.组织样品或杂合子样品常常出现“U"和“M"同时呈现阳性;建议使用基因甲基化程度定量分析试剂盒(20024.3)予以分析

　　12.根据用户PCR仪的性能，决定是否加入矿物油(Mineral Oil)

　　13.建议使用软件测算Tm温度;参考公式为Tm=4(G+C)+2(A+T)

　　14.在-20℃冰箱里储存的产品避免反复冻融

　　基因甲基化特异性PCR扩增(MSP)试剂盒 华远公司主要业务为向大专院校、科研机构，药企、化工企业提供高品质、特殊规格的化学产品和技术解决方案，已经形成了累计服务超过1000家客户，提供高规格产品超过6000种，合作行业和产业伙伴超过1200家的体量和规模，积累了丰富的经验和良好的口碑。基于长期的行业经验和积累，我司已经形成了既能满足研发类客户对产品种类、包装、纯度的特殊要求，也能适应企业从小试、中试到规模化等各个阶段的综合需求的核心能力。