华远ELISA操作指南——酶免疫测定

　　酶免疫测定(enzyme immunoassay,EIA)，是将酶催化作用的高效性与抗原抗体反应的特异性相结合的一种微量分析技术。酶标记抗原抗体后形成的酶标记物，既保留抗原或抗体的免疫活性，又保留酶的催化活性。当酶标记物与待测样品中相应的抗原或抗体相互作用时，可形成酶标记抗原抗体复合物。利用复合物上标记的酶催化底物显色，其颜色深浅与待测样品中抗原或抗体的量相关。该方法灵敏度可达到ng~pg/ml水平。常用的标记物有辣根过氧化物酶HRP和碱性磷酸酶AP等。酶免疫测定分为酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和酶免疫组化技术(enzyme immunohistochemistry technique)，前者用于测定可溶性抗原或抗体，后者用于测定组织或细胞表面的抗原。

　　酶免疫技术

　　均相酶免疫测定技术

　　以标记抗体检测标本中的抗原为例，按照简单的形式在试剂抗体过量的情况下进行：

　　Ab*+Ag—Ab*Ag+Ab*

　　如在抗原抗体反应后Ab*Ag中的标记物“*"失去其特性，例如酶失去其活性，则不需要进行Ab*Ag与Ab*的分离，可以直接测定游离的Ab*量，从而间接推算出标本中的Ag含量，这种方法称为均相酶免疫测定。

　　均相酶免疫测定的测定对象为小分子抗原或半抗原，主要用于药物测定。均相酶免疫测定的测定模式为竞争抑制法，酶标记的是待测抗原，检测试剂中尚有针对待测抗原的抗体和酶的底物。与抗体结合的酶就失去其活力，因此在反应中无需分离结合的酶与游离的酶即可进行测定。其反应过程与一般的生化测定无异，因此可直接用自动生化分析仪进行测定。均相酶免疫测定主要有酶扩大免疫测定技术和克隆酶供体免疫测定两种。

　　异相酶免疫测定技术

　　酶免疫技术是以酶标记的抗体或抗原为主要试剂进行检测的方法，是标记免疫技术的一种，1966年Nakene和Pierce利用酶使底物显色的作用而得到与荧光抗体技术相似的结果，20世纪70年代初，酶标抗体技术开始应用于免疫测定，其后得到迅速发展。近年来标记免疫技术飞速发展，应用不同标记物，根据不同原理、不同技术建立起来的检测方法层出不穷。

　　酶免疫测定(enzymeimmunoassay，EIA)是以酶作为标记物的免疫测定方法，利用酶的高效催化作用提高检测的敏感度。根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游离的酶标记物，酶免疫测定可分为均相(homogenous)和异相(heterogenous)两种类型。相对于均相酶免疫测定技术，异相酶免疫测定在医学检验应用更为广泛，其反应过程中需经过结合标记物和游离标记物的分离才能进行测定。分离的方法主要借助固相载体，即将一种反应物固定在固相载体上，当另一种反应物与之结合后，可通过洗涤、离心等方法令其与液相中的其他物质分离，此类反应亦称为固相酶免疫测定。Engvall和Perimann于20世纪70年代初首先建立这种方法，称之为ELISA。所谓的免疫吸附剂指的是吸附在固相载体上的免疫活性物质ELISA在临床及科研中应用极为广泛，已成为固相酶免疫测定的代名词。

　　固相酶免疫测定方法

　　固相酶免疫测定主要是指ELISA，其基本原理是：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面(包被)，并保持其免疫活性;用酶标记(另一种)抗原或抗体，保留其免疫活性和酶活性;在测定时，把待测标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应;用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例;加入酶反应的底物后，底物被酶催化显色，故可根据颜色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，具有放大反应的效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。根据测定对象的不同，ELISA有多种反应类型。

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