华远详述：探针法荧光PCR检测试剂盒的优势和测量原理

　　探针法荧光PCR检测试剂盒的荧光PCR是使用聚合酶链式反应(PCR)进行的核酸同步扩增和检测/定量的方法。

　　探针法荧光PCR检测试剂盒具有显著的优势，可以实现基因表达的精确定量。特异性好，大大降低了检测的假阳性，灵敏度高，采用灵敏的荧光检测系统对荧光信号进行实时监控，操作简单，无PCR产物污染。省去了最麻烦的基因序列查询、引物探针设计、PCR扩增条件优化等大量费时、费力、费钱的繁琐工作。探针技术解决了荧光染料与非特异性扩增结合的问题，反应结束后无需通过熔解曲线检测，缩短了实验时间。

　　探针法荧光PCR检测试剂盒的原理在于PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。正常情况下两个基团的空间距离很近，荧光基因因淬灭而不能发出荧光。PCR扩增时，引物与该探针同时结合到模板上，探针的结合位置位于上下游引物之间。当扩增延伸到探针结合的位置时，Taq酶利用5'外切酶活性，将探针5'端连接的荧光分子从探针上切割下来，从而使其发出荧光。检测到的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此，根据PCR反应体系中的荧光强度即可计算出初始DNA模板的数量。

　　产品及特点 本产品是基于荧光探针检测的即用型 PCR 试剂盒，可以对靶片段进行实时定量 PCR 分 析(quantitative PCR、qPCR)。产品含有经过优化的缓冲液组分、热启动 Taq DNA 聚合 酶、Taq DNA 稳定剂、dNTPs、MgCl2和稳定剂等所有实时定量 PCR 所需要的成分，用户 只需加入基因组 DNA 或 cDNA 模板、引物和探针即可进行探针法实时定量 PCR 反应，具有 广泛的用途。本产品具有下列特点：

　　1. 以 2×Mix 提供，用户只需准备模板、引物、探针和 ROX 染料(取决于 qPCR 仪器) 即可以进行探针法实时定量 PCR 实验，非常方便快捷，降低了操作误差。

　　2. 各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。灵敏度最高时可以 达到 50 拷贝/反应(跟模板质量，引物设计等相关)。

　　3. 既可用于 TaqMan 探针 qPCR，也可以是分子信标(molecular beacon)探针 qPCR。

　　4. 灵敏度和专一性比染料法荧光定量 PCR 更高。

　　5. 可用于基因表达分析、SNP 分析、拷贝数分析等实验。也可以用于定性检测。

　　6. 本产品只能用于科研，1mL 足够 100 次 20uL 体系的探针法 qPCR 反应。

　　2X 探针法qPCR Mix (TaqMan探针法荧光定量PCR试剂盒)

　　规格及成分 成 份 编 号 塑料袋包装 十孔盒包装

　　2×探针法 qPCR Mix 190303 1 mL(棕色盖) 1 mL(棕色 盖)×10

　　使用手册 190303sc 1 份 1 份

　　2X 探针法qPCR Mix (TaqMan探针法荧光定量PCR试剂盒)运输及保存 低温运输，-20℃保存, 不冻融时保存期限为 24 个月。如果需要每天使用，可在 4℃放置三 周。 自备试剂 DNA 模板、引物、超纯水。

　　使用方法 1. 如果有 N 个样品并且做定量分析，最好设置 N+7 个反应，多出的 7 个中，6 个是做标 准曲线的阳性对照，一个是阴性对照(NC)。在 N+7 个 PCR 管中，加入下列成分。如 果是做定性分析，则 6 个做标准曲线的样品缩减成一个阳性对照(PC)，用户自己需要 根据下表进行适当修改(把 6 个标曲反应改成 1 个阳性对照反应)。

　　成分 N 个样品管 6 个标准 曲线管 NC 管 2×探针法 qPCR MagicMix 各 10 uL 各 10 uL 10 uL 自备引物 1(10uM) 各 1 uL 各 1 uL 1 uL 自备引物 2(10uM) 各 1 uL 各 1 uL 1 uL 自备模板 DNA 基因组 DNA 10-100ng 不加 不加 或 cDNA 1-10ng 不加 不加 自备阳性对照模板(6 各梯度) 不加 各 1 uL(各 加 1 个梯度) 不加 阴性对照模板(一般用水) 不加 不加 1 uL 自备探针(0.5uM) 各 1 uL 各 1 uL 1 uL 自备 50×自备 ROX I 或 ROX II 染料(见注) 各 0.4 uL 各 0.4 uL 0.4 uL 补超纯水到 20 uL 20 uL 20 uL 注，下列信息仅供参考，具体以 qPCR 仪器的使用手册为准。

　　1、不需要 ROX 的机型：Agilent MX3000 和 MX4000、iCycler IQ、LightCycler 480、，、 Smart Cycler System、Thermal Cycler Dice Real Time System 等型号的荧光 PCR 仪 器不需要加 ROX 染料，但加入的话也不会影响整个 PCR 分析。

　　2、需要使用 ROX I 的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step One、 Step One Plus。

　　3、需要使用 ROX II 的机型：ABI Prism7500、7500 Fast、MJ Opticon、MJ Chromo4、 Corbett RotorGene 3000。 2. 放入荧光 PCR 仪中进行扩增, 下表的扩增参数仅供参考，一定需要根据靶分子长度，引 物和探针的 Tm 值、标记染料的种类等进行调节。

　　一般选择三步法 PCR： 步骤 反应参数 备注 预变性 94℃ 2 分钟 PCR(35-45 次循环) 94℃ 15 秒 靶分子 长 度 最 好 在 80-200bp 55-65℃ 15-30 秒 在此步采集荧光信号，通 道根据标记染料决定 72℃ 30 秒 如果引物 Tm 值接近 60℃，也可以选择两步法 PCR： 步骤 反应参数 备注 预变性 94℃ 2 分钟 PCR(35-45 次循环) 94℃ 15 秒 靶分子 长 度 最 好 在 80-200bp 60℃ 60 秒 在此步采集荧光信号，通 道根据标记染料决定 3. 数据处理 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘 制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推 算出其浓度。 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性。一般情况下，阴性对照 Ct 大于或 等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。 对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果 在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小 于 40，则为阳性。

　　探针法荧光PCR检测试剂盒 华远公司主要业务为向大专院校、科研机构，药企、化工企业提供高品质、特殊规格的化学产品和技术解决方案，已经形成了累计服务超过1000家客户，提供高规格产品超过6000种，合作行业和产业伙伴超过1200家的体量和规模，积累了丰富的经验和良好的口碑。基于长期的行业经验和积累，我司已经形成了既能满足研发类客户对产品种类、包装、纯度的特殊要求，也能适应企业从小试、中试到规模化等各个阶段的综合需求的核心能力。公司在技术理念、产品研发、产品合成、产品分析、质量检测、产品存储、产品包装等相关领域，都形成了相对成熟领先的自有体系。