聚焦：华远资讯-细胞免疫荧光实验步骤

　　细胞株免疫荧光主要用于蛋白定位研究和细胞内信号转导，细胞免疫荧光技术是利用免疫技术和荧光标记技术相结合，原理就是利用抗原-抗体反应之后，采用荧光标记，标记完成后，显微镜下观察细胞内某种抗原成分的多少，从而做出一个定位研究，也可以为细胞内信号传导提供一个明确的指导，细胞免疫荧光具有敏感性强、特异性高、速度快的特点，是目前比较常用的组织学技术，也是比较准确的。

　　一、实验方法原理

　　在进行细胞免疫荧光过程中，需要用到细胞爬片，通过将爬片浸在细胞培养基内，细胞在爬片上生长，进而进行细胞的免疫荧光。

　　二、实验材料

　　1.细胞样品

　　2.试剂、试剂盒：多聚甲醛 70%甲醇丙酮 PBS Triton BSA DAPI染液 DABCO Tris 甘油

　　3.仪器、耗材：玻片

　　三、细胞爬片免疫荧光实验步骤

　　第yi天：

　　1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min;

　　2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min;

　　3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min(细胞膜上表达的抗原省略此步骤);

　　4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min;

　　5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜;

　　第二天：

　　6. 加荧光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min;注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。

　　7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5minx4次洗去多余的DAPI;8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

　　注意事项

　　1.取细胞株爬片时，动作应轻柔，防止将细胞爬片夹碎，影响实验进程。

　　2.种细胞过程中，要注意将细胞轻柔混匀，“八”字或者“十”字形摇晃，防止细胞局部生长过密。

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