很多小伙伴在对胶片印迹进行短暂曝光后，检测不到目的蛋白。华远小编可从以下几个方面来优化实验步骤：

　　1、裂解物制备

　　每道全细胞提取物的20–30?g总蛋白，通常足够用来检测。如果靶标蛋白的基础水平，或蛋白质修饰程度低，可能需要通过化学刺激剂来诱导表达或修饰。你可能要调查备选细胞系或组织，其所含的目的蛋白含量更高。应将样品溶解于适当的缓冲液中，该缓冲液包含蛋白酶抑制剂和针对磷酸化目标的磷酸酶抑制剂。应务必对裂解物进行超声处理，以确保有效的染色质和膜结合靶标的蛋白质提取。请查看我们网站上的对照物表，获得推荐的阳性对照物和处理方法。

　　2、一抗稀释和/或孵育

　　使用推荐的封闭剂（5%BSA或5%脱脂奶粉），以推荐的稀释度溶解于TBST中，在4°C下，过夜孵育一抗。使用备选封闭剂，如明胶、血清、无蛋白封闭剂、酪蛋白、或混合封闭剂，可能降低靶标信号强度。如需单个抗体的优化结果，请查询产品数据表找到推荐的稀释缓冲液。

　　3、SDS-PAGE凝胶选择

　　一般来说，推荐采用Tris-Glycine凝胶。但是，对于高分子量蛋白质，我们推荐采用Tris-Acetate凝胶和相关缓冲液。蛋白质从1毫米凝胶转移比从1.5毫米凝胶转移更有效。使用更厚的凝胶，可能会导致高分子量蛋白质的转移不完全，所以我们推荐监测转移效率，根据目的靶标蛋白质分子量大小，优化转移条件。

　　4、转移和膜

　　可通过延长转移时间或使用更高的电压，可改善转膜不完全。一般来说，我们建议在转移缓冲液中加入20%甲醇，然后在70 V电压下进行为时2小时的湿转。对于高分子量蛋白质，我们建议减少转移缓冲液中的甲醇至5%，以提高转移效率并避免大分子蛋白质在凝胶基质中固定，并且在70 V电压下延长转移时间至3小时。检测较小的蛋白质时，可能在转膜期间出现过度转移（过膜蛋白质转移）问题。对于小蛋白质分子，使用孔隙大小为0.2?m的膜并在70 V电压下进行为时1.5小时的湿转，而不是使用孔隙大小为0.45?m的膜或进行过夜转移，这样做很重要，因为后者可能会导致过度转移和丢失小蛋白质分子信号。

　　5、封闭

　　膜封闭时间过长可能会掩盖抗原表位，并阻止抗体结合。在室温下仅封闭1小时。

　　6、洗涤

　　洗涤时间超过推荐的三次5分钟是一个常见问题，可能会导致减少信号。我们推荐计时洗涤，以确保准确性。TBST应包含0.1%Tween?20。这适用于一抗和二抗孵育后的洗涤步骤。此外，我们建议在TBST中洗涤，因为已有数据显示在PBST中洗涤会导致减少信号。

　　7、二抗稀释和/或孵育

　　可用相同的细胞提取物和一抗在印迹上进行二抗的梯度稀释，以优化二抗浓度。务必在室温下，在含5%脱脂奶粉的TBST中孵育二抗1小时。避免在HRP-偶联二抗的缓冲液中加入叠氮/化钠，因为叠氮化物会抑制HRP的活性。

　　8、检测试剂

　　采用能用抗-生物素-HRP进行检测的生物素化分子量标准作为化学发光检测的阳性对照物。

　　蛋白质印迹法 华远公司主要业务为向大专院校、科研机构，药企、化工企业提供高品质、特殊规格的化学产品和技术解决方案，已经形成了累计服务超过1000家客户，提供高规格产品超过6000种，合作行业和产业伙伴超过1200家的体量和规模，积累了丰富的经验和良好的口碑。基于长期的行业经验和积累，我司已经形成了既能满足研发类客户对产品种类、包装、纯度的特殊要求，也能适应企业从小试、中试到规模化等各个阶段的综合需求的核心能力。