蛋白质的(PAGE)聚丙烯酰胺凝胶电泳制备方法

　　一．试剂制备：

　　1.分离胶缓冲液（pH8.9）:36.6gTris,48ml1mol/l的HCl,或先加水至80ml,用浓HCl调pH，再定容至100ml.

　　2.浓缩胶缓冲液（pH6.7）：5.98gTris,48ml1mol/l的HCl,或先加水至80ml,用浓HCl调pH，再定容至100ml.

　　3.30%丙烯酰胺（pH≤7.0）：29g丙烯酰胺和1g甲叉双丙烯酰胺，溶于60ml水中，加热至37?C溶解，补水至100ml，用棕色瓶贮存于室温，几个月后重新配置。

　　4.10％过硫酸铵（W/V）：1g溶于10ml水中，4?C保存数周，尽量现用现配。

　　5.四甲基乙二胺(TEMED)

　　6.10％SDS。将10gSDS溶于80ml重蒸水中并轻缓搅拌（室温低时需水浴加热溶解），再定容至100ml,室温存放。

　　7.样品缓冲液：5ml1mol/l的Tris-HCl（pH6.7），2.5gSDS,1ml巯基乙醇，0.05g溴酚兰，10g蔗糖，加水定容至100ml。

　　8．考马斯亮蓝染色液：0.25g考马斯亮蓝R-250用少量甲醇溶解后，用甲醇(40ml)-乙酸(10ml)水溶液稀释至100ml。

　　9．脱色液：90ml甲醇:水（1:1）和10ml冰醋酸配成100ml脱色液

　　10．Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH8.3）：在900ml去离子水中溶解15.1gTris碱，94g甘氨酸，加入50ml10％（W/V）的电泳级SDS贮液，用去离子水补至1000ml量则成5×贮液。

　　二．电泳

　　1.用1％琼脂将长玻璃板下端封住，冷凝30分，灌12％分离胶（4.9ml蒸馏水，6.0ml30％丙烯酰胺，3.8ml1.5mol/lTris-HCl,150μl10%SDS,150μl 10%过硫酸铵,6μl TEMED），灌到至短玻璃板4cm，用水封住，冷凝30分后将水倒出，吸干，灌满5％浓缩胶（5.5ml蒸馏水，1.3ml30％丙烯酰胺，1.0ml1.5mol/lTris-HCl,80μl10%SDS,80μl 10%过硫酸铵,8μl TEMED）后立即插入梳子，冷凝30分后取出梳子，将1×电泳缓冲液倒入电泳槽，并淹没短玻璃板

　　2.取30μl蛋白提取液与30μl样品缓冲液混合，于100℃水浴加热3min使蛋白变性，用微量进样器以50μl的量注入点样孔，不加样槽注入样品缓冲液。

　　3．以浓缩胶中100V，分离胶中180V电压进行电泳，至距底线1cm时关闭电源

　　4.将电泳后的凝胶取出，置于培养皿中，用蒸馏水冲去残留缓冲液，加入染色液将凝胶完全浸泡其中，放入微波炉内，高火档照射20秒，停留1min，再照射10秒，反复几次至凝胶上色后倒出染色液，用蒸馏水冲去残留染色液，加入脱色液，高火档照射20秒，倒出脱色液，再加入新鲜脱色液照射20秒，重复5－6次，直至背景清晰透明，于凝胶分析仪上成像分析。

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