琼脂糖凝胶电泳法检测DNA及RNA的纯度及浓度
1、DNA 的琼脂糖凝胶电泳检测
(1)配制琼脂糖凝胶
①称取适量琼脂糖，放入100mL锥形瓶中按胶浓度加入1倍 TAE 或 TBE 缓冲液，于微波炉或水浴中溶解。
②熔化的琼脂糖冷却至60℃，加入终浓度为0.5μg/mL 的 EB，混匀。
③将凝胶床水平放置，插入两端的挡板，用滴管吸取少量的凝胶封好胶床边缘。
④放入梳子，使梳齿高于底板0.5～1.0mm。
⑤倒入琼脂糖凝胶溶液，其厚度为3～5mm，放置30～60min，使胶完全硬化。
⑥去掉两端的挡板，将胶床放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，液面高出胶面1～2mm 小心拔出梳子，检查样品孔是否完整。
(2)点样
①取浓度为 1μg/μL 的 DNA 样品5μL，与 5μL 溴酚蓝于封口膜上混合。
②用 20μL 的移液器将样品加入样品孔内。操作时，可用右手持移液器，左手握住右手腕，左肘支撑桌面，防止点样时右手晃动。
③同样操作点上 DNA 分子量标准物。
(3)电泳
将电泳槽置冰箱或冷室中，盖上电泳槽盖，接通电源，样品端接负极(DNA 向阳极移动)，以 5V/cm 电压电泳。
(4)溴酚蓝泳动至胶3/4距离时，可停止电泳，取出凝胶，置短波紫外线(254nm)下观察。植物 DNA 样品应呈现一条迁移率很小的整齐条带，与分子量标准物的迁移率相比大致估计所提 DNA 的相对分子质量大小。
DNA 样品纯度植物总(核)DNA 样品应呈现一条迁移率很小的整齐条带，质粒 DNA 应呈现三条不同构型的条带，这时表明所提样品较纯。如果在溴酚蓝前有弥散的荧光区出现，则表明样品中存有 RNA 杂质，若所提总 DNA 或核 DNA 在0.5%琼脂糖凝胶上不能形成清晰的条带，而只是弥散一片，则表明 DNA 已严重降解。若所提质粒 DNA 样品在质粒条带上端还有荧光条带(迁移率小于质粒 DNA 条带)，表明质粒 DNA 样品中有染色体DNA 污染。
DNA 分子大小与泳动距离相同的标准 DNA 条带的相对分子质量相近。
DNA 样品量比较被测 DNA 样品条带与标准 DNA 样品条带的荧光强度，DNA 量相同时所产生的荧光强度相同。如以 λ-DNA 为标准样品，其浓度为1μg/μL，上样量为 2μL，植物总 DNA 样品条带的亮度与之相近时，其电泳样品量约为2g，根据上样体积可大致估计出样品 DNA 的浓度。对于 λ-DNA 限制性酶切片段的量可将总上样量(xμg)除以总 bp数(约50000bp)再乘上该条带的bp数。
(说明：①配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的 DNA 分子大小来确定。检测植物总 DNA、核 DNA 时，使用0.5%的凝胶;检测大肠杆菌质粒 DNA 时，使用0.8%～1.0%的凝胶。
②制备0.5%以下低浓度凝胶时，可先于胶床上制1%的支持胶，待其固化后将低浓度的胶制于其上，以增加凝固强度;
③若所提总 DNA 或核 DNA 在0.5%琼脂糖凝胶上不能形成清晰的条带，而只是弥散一片，则表明 DNA 已严重降解;
④需要快速检测所提的 DNA 样品时，可采用微型琼脂糖凝胶电泳，配制1%的琼脂糖凝胶10mL，倒在小玻璃板或幻灯片上，自然铺开。梳子用 1mm 厚的有机玻璃制作，齿宽3mm，齿长5mm，齿间距为21nm。点样量为2～5μL，6～7V/cm电压电泳1h检测。
⑤以 λ-DNA 限制性酶切片段为标准样品。
2、RNA 的变性琼脂糖凝胶检测
(1)试剂
①MOPS 缓冲液(10倍)：0.4mol/L吗啉代丙烷磺酸(MOPS)(pH7.0)，0.1mol/L NaAc，10mol/L EDTA。
②上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA，0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。
③甲醛。
④甲酰胺(去离子)。
(2)操作
①将制胶用具用70%乙醇冲洗一遍，晾干备用。
②配制琼脂糖凝胶
a.称取 0.5g 琼脂糖，置于干净的 100mL 锥形瓶中，加入 40mL 蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。
b.待胶凉至60～70℃，依次向其中加入9mL甲醛、5mL MOPS 缓冲液(10倍)和 0.5μL 溴化乙锭，混合均匀。
c.灌制琼脂糖凝胶。
③样品准备
a.取 DEPC 处理过的 500μL 离心管，依次加入如下试剂：MOPS 缓冲液(10倍)2μL，甲醛3.5μL，甲酰胺(去离子)10μL，RNA 样品4.5μL，混匀。
b.将离心管置于60℃水浴中保温10min，再置冰上2min。
c.向管中加入 3μL 上样染料，混匀。
④上样(注意点上 RNA 分子量标准物)。
⑤电泳：电泳槽内加入1倍 MOPS 缓冲液，于 7.5V/mL 的电压下电泳。
⑥电泳结束后，在紫外灯下检查结果。
RNA 样品质量不管是变性凝放电泳还是非变性凝胶电泳，完整的总 RNA 样品应呈现出三条条带，为 28SrRNA，18SrRNA，5 SrRNA。其中 8SrRNA 条带的亮度应约为18SrRNA 8条带亮度的两倍，表明 RNA 样品比较完整，无多少降解。如果两条带的亮度反过来了，说明 28SrRNA 已降解成 18S 大小。如无清晰条带，表明样品已严重降解。如果在点样槽内或槽附近有荧光区带，则表明 RNA 样品中有 DNA 污染。
(3)说明
①RNA 电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%～1.4%的凝胶，不同的RNA 条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA 的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定 RNA 分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总 RNA 样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。
②植物总 RNA 中的 28SrRNA 及 18SrRNA 在变性凝胶上的迁移率相当于分子量 5.1kb 及2.0kbRNA 的迁移率。
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