间充质干细胞【培养基】的成分、种类及选择！

　　【概要描述】培养基是维持间充质干细胞(MSCs)健康、增殖的关键因素，临床级的培养基制剂可显著提高移植干细胞的安全性和质量。

　　细胞培养是生命科学中使用最常见和最复杂的技术之一，培养基是维持间充质干细胞(MSCs)健康、增殖的关键因素。当把它全部分解，所有的MSCs培养基本质上包含相同的基本成分：基础培养基、缓冲系统、谷氨酰胺、特定的生长因子和额外的补充剂、血清(或血清替代物)。

　　在这里，我们将对培养基中一些主要成分、培养基种类及选择作一简要综述。

　　【MSCs培养基的主要成分】

　　Part1.基础培养基

　　经典基础培养基(DMEM、MEM、RPMI等)化学组分明确，每一种都可以用于支持特定的细胞系或培养条件。不同的经典基础培养基之间的主要区别在于缓冲液、盐和细胞生长添加剂的特性和数量。

　　许多基础培养基最初是用小鼠成纤维细胞、HeLa或CHO细胞系开发的，随着时间的推移，已经建立了适合各种细胞类型的基础培养基。例如，DMEM/F12作为一种常用的干细胞基础培养基，它是复合培养基Ham’s F12与DMEM(含有更高浓度的氨基酸与维生素)1:1的混合物

　　Part2.缓冲系统

　　MSCs培养基不仅要满足培养细胞的基本营养需求，而且要适合所使用的培养条件。大多数哺乳动物细胞在pH为7.4时生长良好，保持这个pH值对干细胞培养至关重要。

　　当使用透气培养瓶或培养皿时，大气中的二氧化碳气体溶解到细胞培养基中，并与HCO₃⁻建立平衡。因为二氧化碳是酸性的，所以介质的pH值会降低。虽然介质中的盐和氨基酸可以提供一些缓冲能力，但仍需要添加额外的缓冲化合物。

　　① 碳酸氢钠

　　为了维持CO2培养箱中培养基pH值的稳定，碳酸氢钠(NaHCO3)是一种无毒的天然缓冲液，被添加到干细胞培养基中。

　　根据研究，在5% CO2培养箱中培养时，需要1.5 g/L的NaHCO3来保持培养基的pH为7.4。

　　H2O + CO2 ↔ H2CO3 ↔ H+ + HCO3-NaHCO3 ↔ Na+ + HCO3-

　　② HEPES

　　HEPES是一种两性离子有机缓冲液，也用于维持细胞培养基的生理pH值。

　　当细胞培养系统非常敏感时，为了增加缓冲能力，使pH稳定在7.2至7.6范围内，且不依赖于CO2水平时，建议使用HEPES。

　　③ 酚红

　　除CO2水平外，细胞代谢物、培养基添加剂等多种因素也会影响MSCs培养基的pH值。因此，酚红通常被添加到干细胞培养基中，作为一种可视化的pH指示剂。

　　含有酚红的培养基在pH为7.4时呈现红色，并随着pH的波动从亮黄色到深紫色。呈现黄色或粉红色/紫色的培养基一般不适合干细胞，此时需要立即进行培养基交换、传代或培养箱气体调节等。

　　图1.酚红pH值图 含酚红的介质在pH为7.4时呈现红色，随着pH值的变化从黄色到紫色。

　　Part3.谷氨酰胺

　　细胞需要氮来构建核苷酸、氨基酸和维生素。L -谷氨酰胺是一种必需的氨基酸，是大多数细胞培养基的必需添加剂，可促进培养中氮的储存以及转移到细胞中。当葡萄糖水平低而能量需求高时，尤其是对于快速增殖的细胞类型或在缺氧条件下培养的细胞，谷氨酰胺也是最容易获得的氨基酸之一。但是，当溶解在液体介质中，游离L -谷氨酰胺是相当不稳定的。在4°C以上时，细胞培养基中的L-谷氨酰胺可降解为有毒的铵和焦谷氨酸盐副产物。由于半衰期短，所以L -谷氨酰胺原液必须在-20°C冷冻保存，在使用前添加到新鲜制备的培养基中。

　　Part4.生长因子与其他添加剂

　　① 生长因子

　　生长因子、细胞因子和趋化因子作为细胞的化学信使，是细胞自然分泌的小蛋白质分子，对接收信号的细胞诱导生理效应(增殖、生长或分化)。不同干细胞需要补充特定生长因子的培养基以维持培养物的健康、增殖和分化。例如，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是维持人胚胎干细胞(ES)和诱导多能干细胞(iPS)多能性的关键生长因子，而白血病抑制因子(LIF)是小鼠ES和iPS细胞的主要调节因子。

　　干细胞培养基中使用的生长因子的质量对培养效果有重要影响。细胞培养基中使用的生长因子大部分是重组蛋白，可以在多种类型的细胞和物种中合成，包括大肠杆菌、CHO和人系。使用高活性、高纯度、适当的蛋白质折叠和翻译后修饰的生长因子，可以获得最佳效果。生长因子和细胞因子作为冻干粉储存时是稳定的，但一旦加入培养基，保质期很短。为了避免这些成分的降解，准备小等分的浓缩原液，并在使用前添加到培养基中以达到最佳效果。

　　② 氨基酸

　　除了基础培养基中提供的必需氨基酸和补充的谷氨酰胺、生长因子外，培养基中还经常添加非必需氨基酸(NEAA)，以刺激细胞增殖和延长培养细胞的活力。虽然细胞可以自然合成NEAA，但在培养基中补充NEAA可以减少氨基酸水平低时可能影响细胞生长的潜在副作用。

　　③ 抗生素

　　实验室经常通过补充抗生素来控制细胞培养环境中可能出现的细菌污染物的生长。除了原代细胞分离，在干细胞培养中不需要或不鼓励使用抗生素。常规使用抗生素可以掩盖低水平的细菌污染，产生耐药菌株，掩盖支原体污染的影响，甚至干扰细胞代谢。

　　Part5.血清与血清代替物

　　传统MSCs培养基中一般会添加胎牛血清(FBS)，FBS中含有生长因子、激素、黏附蛋白和其他对细胞增殖和维持至关重要的因子。

　　但是，使用源自动物的胎牛血清只适合于体外研究，而不适用于人类临床应用，主要因为：

　　① 携带异种成分的胎牛血清注入人体内可引起免疫反应;

　　② 胎牛血清可能携带动物源性病原体，如细菌或病毒，可在细胞培养过程中传播到间充质干细胞;

　　③ 胎牛血清中未确定的成分和批次间的差异会影响研究结果和治疗结果的准确性[1]。

　　因此，将传统含FBS的MSCs培养基替换为更安全、能有效维持MSCs特性的无血清培养基，以供临床应用，至关重要。

　　【MSCs无血清培养基的种类】

　　无血清培养基的研究主要有两个方向：

　　① 培养基中不含有任何动物来源的添加组分;

　　② 培养基中不含有任何不明确的添加组分。

　　根据研究方向，可以将其归纳为四种(图2)：

　　①一般意义上的无血清培养基(Serum-free, SF)：添加物质的化学成分不明确，其中可能含有大量的动物来源蛋白;

　　②无异种成分培养基(Xeno-free, XF)：不含动物源性成分，但可能含有人类源性成分;

　　③无动物成分培养基(Animal component-free, ACF)：不含任何来自动物或人类的成分;

　　④化学成分限定培养基(Chemically defined, CD)：所有化学成分明确，浓度确定。

　　图2：培养基开发方向

　　随着临床应用对MSCs的需求日益增加，新型的MSCs培养基制备技术应运而生。目前，开发MSCs无血清培养基有两种策略。

　　策略一：用取自人血的“人源化”补充剂或植物蛋白水解物(HVP)替代胎牛血清，如人血小板裂解物(HPL)或小麦蛋白水解物。

　　① HPL

　　HPL是一种来源于人血小板的无异种源、无动物血清的细胞培养基添加物，可用于开发无血清/无异种成分培养基。HPLs可以从血库收集，那里有不适合病人输血的过期的血小板。

　　HPLs中含有大量的细胞因子、生长因子和蛋白质等物质(表1)，可促进MSCs生长，同时保持其分化潜能和免疫调节特性。

　　② HVP

　　HVP是将小麦、大豆、大米等植物原料，在酸或酶制剂的催化作用下，水解得到的氨基酸及氨基酸多肽的中间混合胶体，再经加工处理后得到的产物。

　　如小麦蛋白水解物作为血清替代物，含有丰富的二肽与多肽，相对于游离氨基酸，这些是MSCs更喜欢的营养。而且，小麦蛋白水解物富含有包含多肽的稳定型谷氨酸盐，被认为是细胞培养中重要的核酸原料，同时也是极好的能量来源。植物蛋白水解物可用于开发无动物成分培养基。

　　策略二：只使用合成的、重组的或人类衍生的纯化物质来配制培养基，而不添加血清或血清替代物作为补充剂。

　　这种培养基即为化学成分限定培养基，它的主要优点为化学成分明确，浓度明确，可精确定量，对每次检测都保证其稳定性，不存在批间差异;同时，它也避免了引入动物源性病原体的可能性。由于此类培养基中缺乏粘附蛋白，大多数需要添加合适的包被液来促进间充质干细胞的贴壁和迁移。

　　目前，已上市了多款无血清/无异种(SF/XF)及化学成分限定(CD)培养基用于MSCs的培养及扩增(表2)，但这些培养基的效果还有待商榷[2]。例如，有研究表明，原代MSCs在StemPro MSC SFM或mTeSR培养基中的培养效果不佳，需要另加人AB血清进行培养，而且，间充质干细胞传代需要较高的细胞接种密度，密度较低会减慢细胞增殖。也有研究报道，MesenCult-XF对间充质干细胞的分离、扩增、表型和分化潜能并没有很好的支持。

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