考马斯亮蓝染色技术原理、提取制备

　　考马斯亮蓝染色是用考马斯亮蓝进行蛋白质染色的方法。考马斯亮蓝是一种阴离子染料，常用考马斯亮蓝G250和R250。考马斯亮蓝 G250在游离状态下呈红色，当它与蛋白质通过疏水结合后变为蓝色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。

　　考马斯亮蓝G250染色可以同时固定和染色，因此能立即观察显色结果，可用来确定电泳时间，观察初步结果。考马斯亮蓝R250染色灵敏度比G250髙得多，但对酸溶蛋白、醇溶蛋白不合适，因为在染色过程中，蛋白质会溶解在染色液或脱色液中。可用于SDS-PAGE 或非变性PAGE蛋白电泳的快速染色，或Western转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。

　　原理：

　　蛋白免疫印迹( Western Blot，WB)是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜(blot)上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。 WB 是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。本SOP包括Western Blot 操作方法及常见问题分析，有助于成功完成 WB。

　　一、蛋白样本提取制备

　　1 细胞或组织裂解

　　2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂

　　3 蛋白定量

　　4 电泳上样样品的准备

　　二、电泳

　　1 PAGE 胶的制备

　　2 蛋白分子量 Marker

　　3 阳性对照

　　4 内参对照

　　5 上样与电泳

　　三、转膜与显色( Western Blot)

　　1 胶中蛋白的检测

　　2 蛋白转膜

　　3 膜上蛋白的检测：丽春红

　　4 膜的封闭

　　5 一抗的孵育

　　6 二抗的孵育

　　7 显色

　　四、常见问题分析与解决方案

　　五、试剂及缓冲液配方

　　一、蛋白样本提取制备

　　蛋白样品制备是 Western Blotting 的第一步，是决定 WB 成败的关键步骤之一。

　　蛋白提取总体原则与注意事项包括：

　　1) 尽可能提取完全或降低样本复杂度使得集中于提取目的蛋白(通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品)。

　　2) 保证蛋白处于可以溶解状态(通过裂解液的pH 、盐浓度、表面活性剂、还原剂等的选择实现)。

　　3) 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等(全程保证在冰盒中低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂)。

　　4) 尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子(通过加入核酸酶或采取不同提取策略)。

　　5) 样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。

　　1-1 细胞或组织裂解

　　1-1-1 细胞裂解

　　1. 培养的细胞经预冷的 PBS 漂洗 2 次;

　　2. 吸净PBS，加入预冷的裂解液(使用前裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂)(0.1 ml /106 cells);结合不同培养板及实际细胞数量级及参照下表加入相应量裂解液：

　　面积(cm2)细胞量(个)裂解液量(μl)96 孔培养板0.320.4-1.0×10520-5024 孔培养板20.3-0.6×10630-6012 孔培养板4.50.6-1.2×10660-1206 孔培养板9.61.2-2.5×106120-2503.5 cm 培养皿81.0-2.0×106100-2006 cm 培养皿212.5-5.0×106250-50010 cm 培养皿550.7-1.5×107700-150025cm2 培养瓶253.0-6.0×106300-60075cm2 培养瓶751.0-2.0×1071000-2000

　　3. 用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的离心管中;不能用细胞刮子刮取的情况可直接冰上裂解30min后用枪多次吹打至细胞完全裂解;

　　4. 4℃摇动 30 min;

　　5. 4℃离心 12000 rpm，20 min;

　　6. 轻轻吸取上清，转移至新预冷的离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀。蛋白样本暂时不作处理时可以放入-80℃保存。

　　7. 目的蛋白非细胞外基质(ECM)或对胰酶不敏感时也可以采用胰酶消化法收集细胞(即细胞吸去培养基，PBS 漂洗 2 次，加入胰酶消化至脱落，加入预冷的PBS，移入预冷的EP管，离心收集细胞，加入预冷裂解液(使用前加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂)，依次按上面4，5，6步骤处理。

　　1-1-2 组织裂解

　　1. 用预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解;

　　2. 将组织块放在圆底的微量离心管或 EP管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C;

　　3. 每约10 mg组织加入约200 μl 预冷的裂解液(使用前加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂)，冰浴匀浆后置于4℃摇动2h，裂解液体积与组织样本量有适当比例(最终的蛋白浓度至少达到1 mg/ml，理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml).

　　4. 4℃离心 12000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀。蛋白样本暂时不作处理时可以放入-80℃保存。

　　1-2蛋白酶抑制剂

　　本实验室使用的蛋白酶抑制剂为PMSF，抑制丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，凝血酶)和巯基蛋白酶(如木瓜蛋白酶)。在水液体溶液中不稳定，30min就会降解一半，应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中。

　　工作浓度一般用1mM，1:100(V/V)加入贮液(100mM PMSF)，样品处理超过1h，补加一次。

　　PMSF剧毒,为了安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作.PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。

　　PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH值的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。pH值为8.0时，20μmmol/l PMSF水溶液的半寿期大约为85min，这表明将PMSF溶液调节为碱性(pH>8.6)并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。

　　除PMSF外，裂解液中还需加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂(做磷酸化蛋白时必须加)，推荐购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或 COOKTAIL，或按下表配制：

　　备注：其中Sodium orthovanadate 配制活化方法如下：所有步聚均需在通风橱中进行：

　　1). 用双蒸水配制100 mM 正矾酸钠溶液;2). 用盐酸HCl 调至pH 9.0;3). 煮沸至溶液无色,尽量减少水分挥发;4). 冷却至室温;5). 再调pH 至 9.0;6). 再煮沸至无色;7). 重复上述过程，直至溶液煮沸冷却后达pH 9.0;8). 用水定容至原体积;9). 分装保存于- 20°C. 溶液变黄则弃之不用。

　　1-3 蛋白定量

　　BCA 法以牛血清白蛋白 (BSA) 作为标准曲线。基于双缩脲原理，碱性条件下蛋白质将 Cu2+ 还原成 Cu1+， BCA(Bicinchoninic 酸)螯合 Cu1+ 作为显色剂，产生兰紫色并在 562 nm 有吸收峰，单价 Cu1+ 与蛋白呈剂量相关性，灵敏性很高，试管法可测范围 20-2000 μg/ml，微孔法为 0.5-10μg/ml。不易受一般浓度去污剂的干扰。可耐受螯合剂、略高浓度的还原剂的影响，40min内抗干扰能力强。

　　BCA测定方法如下：

　　1) 标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂：

　　孔号01234567蛋白标准溶液(μL)01234567去离子水(μL)2019181716151413对应蛋白含量(μg)05101520253035

　　2) 根据样品数量，按 50 体积 BCA 试剂 A 加 1 体积 BCA 试剂 B(50:1)配制适量 BCA 工作液，充分混匀;

　　3) 各孔加入 200μL BCA 工作液;

　　4) 把酶标板放在振荡器上振荡 30sec，37℃放置 30 min，然后在 562nm 下比色测定。以蛋白含量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线;

　　5) 稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为 20μL，加入 BCA 工作液 200μL，充分混匀，37℃放置 30 min后，以标准曲线 0 号管做参比，在 562nm 波长下比色，记录吸光值;

　　6) 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白含量(μg)，除以样品稀释液总体积(20μL)，乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度(单位：μg/μL)。

　　1-4 电泳上样样品的准备

　　1-4-1变性、还原蛋白样本

　　一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列结构(表位)，因此，为使抗体能够达到结合该表位而需要将蛋白样本进行变性，使之打开折叠的空间结构，蛋白变性一般使用含阳离子变性去污剂如 SDS 的上样 buffer (loading buffer)，并于 95-100°C 煮沸5 min，对于多次跨膜蛋白，可以于 70°C 加热 5-10 min，本实验室的上样 buffer 称为5×SDS凝胶还原型加样缓冲液，上样时与样本1：4混合后变性上样即可。

　　SDS是阴离子去污剂、变性剂。氨基酸侧链与 SDS 充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束，蛋白质-SDS 胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异，SDS与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。

　　1-4-2 天然和非还原样本

　　某些抗体识别的表位是非连续氨基酸构成的蛋白三维结构，此种情况则需要进行非变性的 WB，抗体的说明书一般会标注，这种非变性电泳不加 SDS，样本也不需煮沸。某些抗体仅识别蛋白的非还原态，如某些 cysteine 基的氧化态，即loading buffer 和电泳液中不加入β-巯基乙醇和或DTT。

　　data-draft-type="table" data-size="normal" data-row-style="normal">蛋白状态凝胶状态loading buffer电泳缓冲液还原—变性还原和变性有β-巯基乙醇或DTT ，有SDS有 SDS还原—天然还原和非变性有β-巯基乙醇或DTT ，无 SDS无 SDS氧化-变性非还原和变性无β-巯基乙醇或DTT ，有 SDS有 SDS氧化-还原非还原和天然无β-巯基乙醇或DTT ，无 SDS无 SDS

　　注：除说明书特别标注之外，一般情况下，均使用变性和还原电泳

　　二、电泳

　　SDS-PAGE基本原理：

　　1). SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入 SDS 和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS 是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。

　　2). 强还原剂巯基乙醇(或二硫苏糖醇，DTT)可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与 SDS 充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。

　　3). 蛋白质分子结合 SDS 阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。

　　2-1 PAGE胶的制备

　　聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称 Acr)和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，简称 Bis)在催化剂(过硫酸胺或核黄素 AP)和加速剂(四甲基乙二胺 TEMED)作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。

　　聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基的催化，使体系发生氧化还原作用来完成的。催化体系主要有化学催化(AP-TEMED)和光化学催化(核黄素-TMTED)体系。

　　PAGE胶分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳体系中缓冲液 pH 值与凝胶中的相同。带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

　　不连续电泳

　　作用缓冲液 PH凝胶浓度浓缩胶使蛋白样品浓缩pH6.8 Tris-HCl低，2-5%分离胶使蛋白样品分离pH8.8 Tris-HCl高，根据蛋白大小

　　不连续系统的浓缩效应：

　　凝胶层的不连续性：浓缩胶的孔径大，分离胶的孔径小。在电场的作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中遇到的阻力小，移动快。而在小孔胶中遇到的阻力大，移动慢。因此，在两层凝胶的交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。

　　缓冲液离子成分和pH的不连续性：HCl易解离出Cl- ，它在电场中迁移率大，走在最前面，故称为快离子或前导离子。电极缓冲液中的甘氨酸在pH6.8 的缓冲液中解离度很小，仅为 0.1-1%，因而在电场中迁移率很小，称为慢离子或尾随离子。蛋白质均带负电荷，在电场中均移向正极，其有效迁移率介于快慢离子之间，于是蛋白质就在快慢离子间形成的界面处，被浓缩成极窄的区带。当进入pH8.8的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质，因此氯离子和甘氨酸离子沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面，然后分离成多个区带。根据SDS聚丙烯酰胺的有效分离范围选择分离胶浓度。

　　SDS-PAGE胶有效分离范围

　　聚丙烯酰胺胶浓度%线性分离范围/kDa557-2127.536-941020-801212-601510-43

　　分离胶的配置：将二块玻璃板叠放整齐，用夹子两边夹好，将这二块玻璃板固定在底座上。插入配套梳子，在梳子下缘划线，指示灌胶位置，拔去梳子。在分离胶的配置烧杯中按配方加料，混匀后利用移液器将分离胶(避免气泡产生)滴入二块玻璃板之间，至液面达到梳子下缘1cm 处。用移液器缓慢加入饱和正丁醇或水，注意不要冲乱胶面。静置，待分离胶聚合后，倒去或用滤纸吸去水层。

　　浓缩胶的配制：在浓缩胶的配置烧杯中按配比加料，混匀后即刻用移液器加浓缩胶(避免气泡产生)覆于二块玻璃板之间的分离胶之上至满，轻轻插入梳子(插入梳子时一边倾斜直至全部插入，防止产生气泡)。静置待其凝结后，即制成凝胶板。

　　凝胶制成后最少需放置2h或最好湿盒过夜后才能使用，保证交联反应完全。

　　2-2 蛋白分子量 Marker

　　预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪。

　　2-3阳性对照

　　目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物，用于检验整个实验体系和过程的正确性有效性、特别是一抗的质量和效率。建议使用对照，可查阅文献或抗体说明书选择购买或自提对照样本。

　　2-4 内参对照

　　管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个 WB 实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照必须设立。

　　内参名称分子量大小适用范围β-actin43kDa胞浆和全细胞GAPDH30-40 kDa胞浆和全细胞Tubulin55 kDa胞浆和全细胞VCDA1/Porin31 kDa线粒体COXIV16 kDa线粒体Lanin B166 kDa细胞核(不适于去除核膜的样本)TBP38 kDa细胞核(不适于去除DNA的样本)

　　2-5上样电泳

　　蛋白抗原上样量为30 ug。根据样品量选择SDS-PAGE电泳玻璃板间隙厚度，一般0.75mm间隙15孔的上样量 < 15uL/孔，1mm间隙10孔的上样量 < 30ul/孔。

　　上样：将二块玻璃板制成的凝胶板子上的夹子卸去，将凝胶板垂直靠在电泳槽里的电源架上，使凝胶板的凹沿面靠向电源架。通常两块凝胶板共用一个电源架。将凝胶板与电源架按要求固定于电源槽内。按要求加入电泳缓冲液，使分别加入在两块凝胶板中间电源架内的电泳缓冲液与加入在电泳槽中的电泳缓冲液互不相通。轻轻地拔去凝胶板内的梳子。取处理后的样品液，用微量进样器吸取适量样品液，将样品液缓缓加入凝胶板内地凹口部位(样品点入处)。注意不要冲散样品。

　　电泳：用二根导线连接电泳槽与电泳仪，注意红色与黑色电极的插头和插口相配。电泳时上层胶使用低电压恒压电泳，打开电源将将电压调到80v(一般15min左右)，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高压恒压电泳，将电压调到120v至溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳。

　　三、转膜与显色

　　3-1胶中蛋白的检测

　　电泳后检测蛋白是否迁移正确与平均，可采用锌染(负染)、胶染(blue silver)或考马斯蓝染色检测，如果凝胶中的蛋白需要进行转膜则需可逆的锌染法，否则可以采用不可逆考马斯亮蓝法染色。

　　锌染法(负染)：电泳胶用蒸馏水洗30秒，加入含0.1% SDS 的0.2 M 咪唑溶液摇动染色 10-15 min，再用去离子水洗数秒，加入0.2 M ZnSO4溶液摇动直至在暗背景下蛋白出现透明条带(约1min)，移去ZnSO4溶液加入去离子水中止显色;胶置于0.1- 0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0 缓冲液中漂洗脱色两次，再置于电转缓冲液中开始转膜。

　　胶染(blue silver)法：电泳胶用蒸馏水洗数30秒，考马斯亮蓝G-250染液室温染色1h至过夜，保持摇匀，回收染液，倒入数次去离子水摇动至脱去多余的染料，蛋白被染成深蓝色。

　　考马斯亮蓝R250法：电泳胶用蒸馏水洗数30秒，考马斯亮蓝R-250染液室温染色1h至过夜，保持摇匀，回收染液，用蒸馏水洗数分钟，倒入脱色液摇匀至脱去多余的染料，蛋白被染成深蓝色。

　　考马斯亮蓝快速染色脱色方法： a. 电泳结束后，取胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。通常对于胶浓度大于10%的胶比较坚韧，在发生煮沸时不易破损;对于胶浓度小于10%的胶，宜尽量避免煮沸，以免出现胶碎裂的情况。 b. 随后在染色液温度较高的情况下，在室温摇床上摇动5-10分钟。 c. 回收染色液。d. 加入适量脱色液，确保脱色液可以充分覆盖凝胶。e. 微波炉加热至接近沸腾或刚刚沸腾，立即停止加热。 f. 随后在脱色液温度较高的情况下，在摇床上摇动5-10分钟。此时通常可以观察到比较清楚的蛋白条带。 g. 更换新鲜的脱色液，重复步骤e和步骤f，直至蓝色背景基本上全部被脱去，蛋白条带染色效果达到预期。 h. 完成脱色后，可以把凝胶保存在水中，用于后续的拍照等。保存在水中的凝胶会发生溶涨。如需避免溶涨，可以把胶保存在含20%甘油的水中。长期保存可以制备干胶。

　　考马斯亮蓝染色华远公司主要业务为向大专院校、科研机构，药企、化工企业提供高品质、特殊规格的化学产品和技术解决方案，已经形成了累计服务超过1000家客户，提供高规格产品超过6000种，合作行业和产业伙伴超过1200家的体量和规模，积累了丰富的经验和良好的口碑。基于长期的行业经验和积累，我司已经形成了既能满足研发类客户对产品种类、包装、纯度的特殊要求，也能适应企业从小试、中试到规模化等各个阶段的综合需求的核心能力。