1. 样本准备应该遵循的基本原则

1. 1. 代表性原则

取样的代表性关系到实验结果是否具有科学意义，因此您应该根据实验目的慎重选择您的取样方案。病变组织样本中应不夹带正常组织，正常组织样本中不能含有病变组织。有条件时，应做到实验组与对照组的样本在取材时间、部位、处理条件等方面尽可能保持一致，否则可能会影响实验结果的可信度。

1. 2. 准确性原则

代表性样本的各种特征数据必须被准确记录，并按要求（低温、迅速）采集、制备、贮存、运输，最终正确地按实验设计进行实验和数据处理。

1. 3. 迅速性原则

样本质量是表达谱芯片实验中影响实验结果的最关键因素，因此用于表达谱芯片研究的样本，在采集、制备、贮存、运输过程中应尽可能地做到迅速，最大限度的缩短从样本采集到实验的时间。

1. 4. 低温原则

所取样本离体后，应尽快置于液氮、干冰或-80℃冰箱中，并保证在实验前始终处于-70℃以下，以避免DNA/RNA的降解。

2. 样本准备的方法

1. 1. 贴壁细胞
      1. RNA（TRIzol）
         1. 贴壁细胞培养诱导结束后，去除培养液；
         2. 加入适量的PBS缓冲液冲洗一次，彻底去除PBS缓冲液
         3. 按每10 cm2 （相当于六孔板一个孔或35mm直径培养皿）细胞加1mL TRIzol 试剂的比例加入TRIzol 试剂；
         4. 使用玻璃滴管（或移液器Tip头）反复吹打细胞，直至看不见成团的细胞块，使之充分溶解于TRIzol 中形成清亮不粘稠的液体；
         5. 将TRIzol液体全部转移到RNase-free 的试管中
         6. 放入-80℃冰箱中保存。

1. 1. 2. miRNA（Life Technologies，mirVana miRNA Isolation kit）
         1. 贴壁细胞培养诱导结束后，去除培养液；
         2. 加入适量的PBS缓冲液冲洗一次，彻底去除PBS缓冲液；
         3. 按每105-107的细胞加入600μl Lysis/Binding Solution（我公司可免费提供）；
         4. 使用移液器Tip头反复吹打细胞，直至看不见成团的细胞块，使之充分溶解于裂解液中形成清亮不粘稠的液体；
         5. 将液体全部转移到RNase-free 的试管中；
         6. 放入-80℃冰箱中保存。

1. 1. 3. ELASA
         1. 贴壁细胞培养诱导结束后，收集上清；
         2. 4度1000g x10min，分装成单次检测的用量于-80中保存；

1. 1. 4. Western blot以及IP等
         1. 贴壁细胞培养诱导结束后，去除培养液；
         2. 加入适量的PBS缓冲液冲洗一次，彻底去除PBS缓冲液；
         3. 加入适量的PBS缓冲液，用细胞刮将细胞完全刮离下来，移液器转移到进口EP管中；
         4. 放入-80中保存
      5. DNA（QIAGEN DNeasy kit）
         1. 胰酶消化并收集约1-4x106细胞（60mm培养皿或T25培养瓶），转移到1.5ml离心管中；
         2. 3000rpm离心5min，去胰酶；
         3. PBS轻轻吹打清洗一次。3000rpm离心5min，去上清；
         4. 放入-80℃冰箱中保存。

1. 2. 悬浮细胞
      1. RNA（TRIzol）
         1. 悬浮细胞培养诱导结束后，去除培养液；
         2. 保留的细胞用PBS 缓冲液快速洗一次，离心除去PBS 缓冲液；
         3. 按照每5×106 个细胞加1 mL TRIzol 的比例加入TRIzol 试剂，使用玻璃滴管（或移液器Tip头）反复吹打细胞直至看不见成团的细胞块，使之充分溶解于TRIzol 中形成清亮不粘稠的液体；
         4. 放入-80℃冰箱中保存。

1. 1. 2. miRNA（Life Technologies，mirVana miRNA Isolation kit）
         1. 悬浮细胞培养诱导结束后，去除培养液；
         2. 保留的细胞用PBS 缓冲液快速洗一次，离心除去PBS 缓冲液；
         3. 按照每105-107的细胞加入600μl Lysis/Binding Solution（我公司可免费提供）；
         4. 使用移液器Tip头反复吹打细胞，直至看不见成团的细胞块，使之充分溶解于裂解液中形成清亮不粘稠的液体；
         5. 将液体全部转移到RNase-free 的试管中；
         6. 放入-80℃冰箱中保存。

1. 1. 3. LASA
         1. 贴壁细胞培养诱导结束后，4度1000g x10min收集上清；
         2. 分装成单次检测的用量于-80中保存；

1. 1. 4. Western blot以及IP等
         1. 悬浮细胞培养诱导结束后，离心4度，800g x5min去除培液；
         2. 同法加入适量的PBS缓冲液冲洗一次；
         3. 加入适量的PBS缓冲液，于-80中保存

1. 1. 5. DNA（QIAGEN DNeasy kit）
         1. 收集约1-4x106细胞（60mm培养皿或T25培养瓶），转移到1.5ml离心管中；
         2. 3000rpm离心5min；
         3. PBS轻轻吹打清洗一次。3000rpm离心5min，去上清；
         4. 放入-80℃冰箱中保存。

1. 3. 全血
      1. RNA（PAXgene blood RNA kit）
         1. 抽提RNA用于表达谱芯片，建议采用BD的PAXgene管抽取全血。使用淋巴细胞分离液或红细胞裂解液会使活细胞处于应激状态，从而影响细胞的基因表达；
         2. PAXgene管抽取全血；
         3. 采血以后，颠倒混匀8-10次；
         4. 4℃放置过夜后转入-20℃或-80℃冰箱中保存。

1. 1. 2. DNA（QIAGEN DNeasy kit或FlexiGene DNA kit）
         1. 用EDTA抗凝管抽取1-2ml全血；
         2. 颠倒混匀抗凝管8-10次，充分混匀EDTA和全血，保证抗凝效果；
         3. 放入-20℃冰箱中保存。

1. 4. 血浆
      1. miRNA（mirVana PARIS kit）
         1. 注：该方法可能会去除病毒颗粒；
         2. 采集外周血2mL（采血时间一般为早晨或上午），迅速转入EDTA抗凝管中，涡旋或用移液器Tip混匀；
         3. 在1小时（室温条件下）或2小时(4℃条件下)内进行下面的操作：4℃，8200g（9,400rpm）离心10分钟；
         4. 吸约1mL上清转至洁净的1.5 mL离心管中，16,000g (13,200rpm), 4℃,离心10分钟，小心吸取上清到新的离心管中；
         5. 放入-80℃冰箱中保存。

1. 5. 动物组织
      1. RNA，miRNA，DNA和蛋白
         1. 首先准备好用于包装样本冷冻保存管，并且用油性记号笔在冻存管外表多处写明样本编号；
         2. 准确切除所需组织后，立即剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织。务必将组织分割成小块；
         3. 在生理盐水或PBS中迅速漂洗样本，以去除血渍和污物；
         4. 用镊子夹住样本，放入液氮中冷却样本；
         5. 放入准备好的冷冻保存管中，迅速投入液氮冷却。然后转入-80℃冰箱中保存；
         6. 填写样本登记单，写明样本名称、组织类型、编号、取样
      2. 石蜡切片
         1. 首先准备好用于包装样本保存管，并且用油性记号笔在冻存管外表多处写明样本编号；
         2. 准确切除所需组织后，立即剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织。务必将组织分割成小块；
         3. 在生理盐水或PBS中迅速漂洗样本，以去除血渍和污物；
         4. 用镊子夹住样本，放入中性甲醛固定液中固定过夜
         5. 填写样本登记单，写明样本名称、组织类型、编号、取样

1. 5. 3. 冰冻切片
         1. 首先准备好用于包装样本锡箔纸，并且用油性记号笔在锡箔纸外表多处写明样本编号；
         2. 准确切除所需组织后，立即剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织。务必将组织分割成小块（大约5mm）；
         3. 用用镊子夹住样本，放入胶囊大小的OCT包埋液中；
         4. 在液氮中冻结后放入锡箔纸中包裹起来。然后转入-80℃冰箱中保存；
         5. 填写样本登记单，写明样本名称、组织类型、编号、取样
   6. 临床组织标本 
      1. RNA，miRNA，DNA和蛋白
         1. 首先准备好用于包装样本冷冻保存管，并且用油性记号笔在冻存管外表多处写明样本编号；
         2. 准确切除所需组织后，立即剔除非研究所需的组织，并将组织分割成小块；
         3. 用镊子夹住样本，放入液氮中冷却样本；
         4. 放入准备好的冷冻保存管中，迅速投入液氮冷却。然后转入-80℃冰箱中保存；
         5. 填写样本登记单，写明样本名称、组织类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。
      2. 石蜡切片
         1. 首先准备好用于包装样本保存管，并且用油性记号笔在冻存管外表多处写明样本编号；
         2. 准确切除所需组织后，立即剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织。务必将组织分割成小块；
         3. 在生理盐水或PBS中迅速漂洗样本，以去除血渍和污物；
         4. 用镊子夹住样本，放入10倍体积的中性甲醛固定液中固定过夜
         5. 填写样本登记单，写明样本名称、组织类型、编号、取样
      3. 冰冻切片
         1. 首先准备好用于包装样本锡箔纸，并且用油性记号笔在锡箔纸外表多处写明样本编号；
         2. 准确切除所需组织后，立即剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织。务必将组织分割成小块（大约5mm）；
         3. 用用镊子夹住样本，放入胶囊大小的OCT包埋液中；
         4. 在液氮中冻结后放入锡箔纸中包裹起来。然后转入-80℃冰箱中保存；
         5. 填写样本登记单，写明样本名称、组织类型、编号、取样

1. 7. 植物组织 
      1. RNA，miRNA，DNA和蛋白
         1. 准确取得所需组织后，立即用准备好的铝箔包裹组织；
         2. 立即投入液氮冷冻；
         3. 填写样本登记单，写明样本名称、组织类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。
      2. 石蜡切片
         1. 首先准备好用于包装样本保存管，并且用油性记号笔在冻存管外表多处写明样本编号；
         2. 准确切除所需组织后，立即剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织。务必将组织分割成小块；
         3. 在生理盐水或PBS中迅速漂洗样本，以去除血渍和污物；
         4. 用镊子夹住样本，放入10倍体积的酒精-福尔马林-甘油固定液中
      3. 冰冻切片
         1. 首先准备好用于包装样本锡箔纸，并且用油性记号笔在锡箔纸外表多处写明样本编号；
         2. 准确切除所需组织后，立即剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织。务必将组织分割成小块（大约5mm）；
         3. 用用镊子夹住样本，放入胶囊大小的OCT包埋液中；
         4. 在液氮中冻结后放入锡箔纸中包裹起来。然后转入-80℃冰箱中保存；
         5. 填写样本登记单，写明样本名称、组织类型、编号、取样

3. 样本包装

1. 1. 注意事项
      1. 在包裹样本的铝箔或冷冻保存管表面，用油性记号笔标明样本编号及样本类型。并且不要与乙醇等有机溶剂接触。
      2. 不要用纱布、纸张直接包裹样本，而是用铝箔或冷冻保存管包裹后再装入样本袋中。
      3. 不要用玻璃容器在液氮中保存样本；样本包装中不要使用透明胶带。
      4. 不要把标签纸或其他纸制的说明性文件放入样本袋内，因为纸张在液氮中是易碎的。
      5. 标签纸应该贴于样本袋绳上，不要贴于容器表面以免脱落造成样本混乱。
      6. 不要在一只样本袋中放过多的样本，以防无法放入液氮罐或无法从液氮罐中取出。样本袋在使用前先在液氮中预冷。
      7. 客户在填写《样本登记单》时应当详细描述样本的类型、处理方法、储存条件以及储存时间等相关细节，以便技术人员确定合理的实验方案。

4. 样本储存

1. 1. 样本冷冻储存
      1. 组织样本采集后，样本迅速放入进口高质量冻存管中，拧紧后立即放入液氮。然后再转移到-80℃中保存。
      2. 组织样本储存于液氮或-80℃冰箱中。对于液氮保存样本，务必注意，不要用Eppendorf管和国产冻存管，因为这些管子从液氮中取出时极易发生管子爆裂而造成样本损失。
      3. 细胞样本经Trizol处理后储存于-80℃冰箱中。在-20℃冰箱中储存不宜太久。
      4. 血液样本建议使用PAXgene管（BD）保存。
      5. RNA样本储存于-80℃冰箱中。

1. 2. RNAlater 
      1. RNAlater的简介
         1. RNAlater是一种液态的，无毒的组织保存试剂。它能迅速稳定组织，保护非冷冻细胞RNA于原位。获得组织块后，迅速浸泡在RNAlater中保存，而不会引起RNA的降解，这样可以不必马上处理样本或将样本冷冻在液氮之中。RNAlater应保存在室温下，保质期6个月。如放置在4℃条件下则会引起沉淀，此时需加热到37℃才可澄清。 RNAlater可广泛应用于多种脊椎动物样本。包括脑、心、肾、脾、肝、睾丸、骨骼肌、脂肪、肺和胸腺。RNAlater对大肠杆菌、果蝇、组织培养细胞、全血细胞和一些植物也有效。
         2. RNAlater能否与RNA提取试剂盒兼容？ RNAlater可与大多数RNA提取方法相协调。特别是TRIzol，TRI Reagent，RNAqueous, and Poly(A)Pure。

1. 1. 2. 如何使用RNAlater
         1. RNAlater只能用于新鲜组织，在浸入RNAlater之前不能冷冻组织。简单切碎组织样本，至少一边的最大厚度不能大于0.5cm, 然后将组织碎块放入到5倍体积的RNAlater中，4℃放置过夜后，转入-20℃保存，如需转入-80℃冰箱，请在4℃放置过夜后，吸去RNAlater再放入-80℃冰箱。
         2. 动物组织：RNAlater不会溶解或破坏组织样本的结构。如果需要的话，仍可将已经平衡在RNAlater溶液中的组织取出并分割成更小的块再重新放入到RNAlater中。小器官如鼠肝、肾和脾可以完整地保存在RNAlater中。
         3. 植物组织：许多植物组织可以简单浸泡在5倍体积的RNAlater中保存。具有自然屏障防止扩散的植物如蜡表皮的叶组织可能需要先破坏其屏障，以允许RNAlater进入组织
         4. 不要将全血、血浆或血清中的RNA保存在RNAlater中，因为它们蛋白含量过高，与RNAlater混合后易形成不溶的沉淀。
         5. 细菌( 以下内容是根据Ambion公司的产品说明书编译的，仅供参考)RNAlater是抑菌的，虽然细菌在RNAlater中不能生长，但细胞仍保持其完整性。大肠杆菌保存在RNAlater中4℃条件下1个月仍很完整，产生不降解的RNA。

1. 1. 3. RNAlater中样本的保存
         1. 保存于-80℃：建议用于批量保存。将样本在4℃条件下孵育过夜，然后从RNAlater溶液中取出样本保存于-80℃。对于组织培养细胞，不必移去RNAlater，只需简单冻存整个溶液。实验证明，细胞在-80℃条件下冻存于RNAlater溶液中并未出现溶解。样本可随后在室温下解冻及再冻存，其RNA的质和量都不会受到影响。
         2. 保存于-20℃ 建议用于批量保存。将样本在4℃条件下孵育过夜，然后转移到-20℃。样本在-20℃条件下不会冻结，但在存贮缓冲液中会有结晶形成，这并不影响随后的RNA提取。样本可随后在室温下解冻及再冻存，RNA的质和量都不会受到影响。
         3. 保存于4℃：厂家认为，目前尚无证据证明样本存于4℃ 1个月内会出现RNA降解。
         4. 如果没有冰箱： 将样本放在尽可能冷的环境中。如果周围温度超过25℃，应尽可能使RNAlater中的样本冰浴数小时。

1. 3. RNAsecure（Life Technologies） 
      1. 简介 RNAsecure可代替DEPC，优点有：
         1. 可以加入到不能用DEPC处理的溶液中（如：Tris或MOPS缓冲液）；
         2. 可以加入到不能被高压灭菌的溶液中；
         3. 可以加入到加酶之前的酶促反应中。Ambion已经测试了有RNAsecure 试剂存在的如下酶促反应（先于酶加入）：RNA多聚酶T7，T3和SP6的体外转录（37℃），MMLV和AMV逆转录（42℃），以及SuperTaq PCR（94℃），均没有出现酶抑制现象。
      2. 使用方法
         1. 用缓冲液或经过处理的溶液稀释RNAsecure试剂到1×，充分混匀。
         2. 将混合物在60℃水浴温浴20 min，冷却至室温。这样的溶液可用于接下来的RNA提取和分析，或者保存于室温、4℃或-20℃以备将来使用。
         3. 为了消除任何可能发生在经过初处理之后的RNA酶的污染，在使用前可以将RNAsecure溶液在60℃水浴中重新温浴10~20分钟。
         4. 注意事项 RNAsecure 试剂只在高于45℃的条件下才有活性，但当反应体系孵育温度超过该温度时可能会使一些酶失活。因此，用RNAsecure处理反应缓冲液时要以加入酶之前做为临界点，然后进行酶促反应时孵育温度低于45℃。注意：这不适用于Taq 多聚酶。

5. 样本运输

1. 1. 干冰运输
      1. 飞机运输干冰上限约为2公斤，超过2公斤原则上不能运输。火车运输不受限制。
      2. 干冰运输应采用壁厚且质量完好的泡沫箱，材料用编号后的冻存管存放，用塑料袋包装后埋入干冰中，泡沫箱应扣严并用封箱带封严。外套纸壳箱包装，以免碰裂。并标明轻取轻放提示，以保证安全运输。
      3. 干冰运输可委托当地快递公司，注意一定要确保48小时送达我方手中，不能送货上门的应提前通知我方。
      4. 24小时到达的，干冰数量不得低于5公斤；48小时到达的，干冰数量不得低于8公斤。夏季可以适当再多增加部分干冰（平时的1.5倍）。超过48小时到达的，建议不要用此法运输。
      5. 运输时可在干冰上再放一排液体冰袋。
      6. 如委托快递运输，运输过程中应随时跟踪货物的情况，记录货单号，并保持与发出地和接收地的快递公司的联系。

1. 2. 冰袋（Gel Ice or Ice Pack）
      1. 如能确保样本在24小时内到达本公司的，以下几种类型样本可使用冰袋运输。
      2. 保存于RNAlater中的组织样本。
      3. 保存于TRIzol中的细胞样本或经过匀浆的组织样本。
      4. 用于抽提DNA的新鲜抗凝全血样本。

6. 注意事项

1. 1. 我们不接收未经TRIzol 试剂处理的细胞样本以及非PAXgene管保存的全血样本抽提RNA或miRNA。

1. 2. 客户如果提供冻存可复苏的细胞株，应首先验证所用冻存方法用于RNA 提取的可靠性，并且在送样时提供详尽的复苏方法，以便确保实验成功。

1. 3. 所有样本均应标明准确的样本编号，同时配有一张样本登记表，写明样本名称、物种、编号、取样日期、样本处理情况等。

1. 4. 提取RNA的得率
      1. 处于不同发育阶段以及不同生长条件的样本中所含有的RNA 的量是不同的，在某些实验条件下或某些病变部位获得的样本中RNA 的量可能与常规相应样本有显著的差异。
      2. 储存条件以及储存时间也是影响RNA 得率的关键因素，一般来说从新鲜的样本中总是能够得到预期的RNA 产量，但是没有保存在液氮或-80℃冰箱中的样本是不可靠的。即使是保存在液氮或-80℃冰箱中的样本，如果储存时间过长，RNA产量也会显著降低。因此，实验中细胞样本的需要量只能以本公司的抽提结果为准。

1. 5. 关于备份
      1. 为确保实验的顺利，我们强烈建议您在取样时，应同时备份2~3份，如备份3份，则送给我们两份，如果备份2份，则送样一份，您自己留一份，以防备部分样本降解，重新取材或送样耽误您的时间。即使样本全部合格，备份的样本您还可以用来进行其他方面的实验（如定量验证，蛋白方面，生化方面的实验等）。
      2. 备份又分为两种，一种为严格备份，即：样本取下后一分为二，这样的两份样本基本上具备同性质。另一种为非严格备份，即生物学重复的样本，这样的备份样本同质性要较前者差。