抗生素残留检查法(培养法)实验步骤

　　本法系依据在琼脂培养基内抗生素对微生物的抑制作用，比较对照品与供试品对接种的试验菌产生的抑菌圈的大小，检查供试品中氨苄西林或四环素残留量。

　　磷酸盐缓冲液(pH6.0)的制备 称取磷酸二氢钾8.0g、磷酸氢二钾2.0g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃灭菌30分钟。

　　抗生素Ⅱ号培养基的制备 称取胨6g、牛肉提取粉1.5g、酵母浸出粉6g，加入适量水溶解后，加入琼脂13～14g，加热使之溶胀，滤过除去不溶物，加入葡萄糖1g，溶解后加水至1000ml，调pH值使灭菌后为6.5～6.6;分装于玻璃管或锥形瓶中，经115℃灭菌30分钟，4℃保存。

　　对照品溶液的制备 取氨苄西林对照品适量，用0.01mol/L盐酸溶解并稀释成每1ml中含氨苄西林10mg的溶液，精密量取适量，用磷酸盐缓冲液稀释成每1ml中含1.0μg的溶液。

　　取四环素对照品适量，用生理氯化钠溶液溶解并稀释成每1ml中含0.125μg的溶液。

　　菌悬液的制备：

　　(1)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)悬液 用于检测氨苄西林。取金黄色葡萄球菌(CMCC 26003)营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，35～37℃培养20～22小时。临时用，灭菌水或0.9%无菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。

　　(2)藤黄微球菌(Microccus luteus)悬液 用于检测四环素。取藤黄微球菌[CMCC (B)28001]营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，置26～27℃培养24小时。临用时，用0.9%无菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。

　　检查法 取直径8cm或10cm的培养皿，注入融化的抗生素Ⅱ号培养基15～20ml，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层。取抗生素Ⅱ号培养基10～15ml置于50℃水浴预热的试管中，加入0.5%～1.5%(ml/ml)的菌悬液300μl混匀，取适量注入已铺制底层的培养皿中，放置水平台上，冷却后，在每个培养皿上等距离均匀放置钢管(内径6～8mm、壁厚1～2mm、管高10～15mm的不锈钢管，表面应光滑平整)，于钢管中依次滴加供试品溶液、阴性对照溶液(磷酸盐缓冲液)及对照品溶液。培养皿置37℃培养18～22小时。

　　结果判定：

　　对照品溶液由抑菌圈，阴性对照溶液无抑菌圈。供试品溶液抑菌圈的直径小于对照品溶液抑菌圈的直径时判为阴性;否则判为阳性。

　　【附注】本试验应在无菌条件下进行，使用的玻璃仪器、钢管等应无菌。

　　抗生素 华远公司主要业务为向大专院校、科研机构，药企、化工企业提供高品质、特殊规格的化学产品和技术解决方案，已经形成了累计服务超过1000家客户，提供高规格产品超过6000种，合作行业和产业伙伴超过1200家的体量和规模，积累了丰富的经验和良好的口碑。基于长期的行业经验和积累，我司已经形成了既能满足研发类客户对产品种类、包装、纯度的特殊要求，也能适应企业从小试、中试到规模化等各个阶段的综合需求的核心能力。