酵母RNA的提取及组份鉴定(稀碱法)说明

　　实验原理

　　由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯/酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯/酚法又是实验是最/常用的。组织匀浆用苯/酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的 RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。

　　酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。

　　RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解，从水解液中可用定糖，定磷和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。

　　试剂和器材

　　一、试剂

　　0.04M NaOH溶液;95%乙醇;1.5M硫酸;浓氨/水;0.1M硝酸/银。

　　酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mL HCl。

　　三氯/化铁浓盐溶液：将2mL 10%三氯/化铁(FeCl3· 6H2O)溶液加入400mL浓HCl。

　　苔黑酚(3,5-二羟基甲/苯)乙醇溶液：称取6g苔黑酚溶于95%乙醇100mL。

　　定磷试剂：

　　17%硫酸：将17mL浓硫酸(比重1084)缓缓倾入83mL水中;

　　2.5%鉬酸铵：2.5g鉬酸铵溶于100mL水中;

　　10%抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100mL 水，棕色并保存溶液;

　　临用时将三种溶液和水按下列比例混合：

　　17%硫酸：2.5%鉬酸铵：10%抗坏血酸：水=1：1：1：2(V/V)。

　　二、材料

　　干/酵母粉。

　　三、器材

　　移液管0.2mL(×1),2.0mL(×1), 1mL(×4); 量筒10 mL(×1), 50mL(×1); 滴管;水浴锅;离心机。

　　操作方法

　　一、酵母RNA提取

　　称5g干/酵母粉悬浮于30mL 0.04M NaOH溶液中并在研钵中研磨均匀。悬浮液转入三角烧瓶，沸水浴加热30min，冷却，转入离心管。3000转/分，离心15分钟后，将上清慢慢倾入 10mL酸性乙醇，边加边搅动。加毕，静置，待RNA沉淀完全后，3000r/min离心3min。弃去上清液。用95%乙醇洗涤沉淀两次。再用乙mi洗涤沉淀一次后，用乙mi将沉淀转移至布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量，计算：

　　二、RNA组份鉴定

　　取2g提取的核酸，加入1.5M硫酸10mL, 沸水浴加热10分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。

　　1.嘌呤碱：取水解液1mL 加入过量浓氨/水。然后加入1mL 0.1M硝酸/银溶液，观察有无嘌呤碱银化合物沉淀。

　　2.核糖：取水解液1mL，三氯/化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴中10min。注意观察核糖是否变成绿色。

　　3.磷酸：取水解液1mL，加定磷试剂1mL。在水浴中加热观察溶液是否变成蓝色。

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