华远技术干货—WB实验代测中的显影原理
WB实验代测，客户只需要提供样本，其余所有试剂均由我司提供，下面我们就做WB实验代测的原理以及大致需要的试剂做了一个汇总。
western免疫印迹是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与southern或northern杂交方法类似，但western免疫印迹采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
1、western blot的原理
原理：先制备蛋白质样品，再利用sdspage原理，分离不同的蛋白质，再将分离的蛋白质进行转膜，以便固定在新膜上进行抗原抗体结合。用固定在膜上的蛋白质作为抗原与对应的非标记抗体(一抗)结合。由于此过程中，可能有未结合到抗原的抗体遗留，故需要清洗，以便保存特异性结合的抗原抗体结合物。抗原抗体结合物暴露出一个fc片段，相应的二抗可以结合到这个片段上，形成抗原一抗二抗结合物，再用相应的过氧化物酶或碱性磷酸酯酶标记到二抗上，由于加入的标记物相对质量分子很大，可以用离心作用将其沉淀下来，如果抗原与抗体结合，便可以一起沉淀下来，最后通过显色反应或放射自显影法便可检测凝胶中的蛋白成分了。 其实原理很简单，你要坚持某种蛋白在样品中是否含有或者大致的量，你就可以先购买或制备该蛋白的抗体，之后通过电泳实验，将蛋白样品简单分离，可以是按分子量分离也可以是按等电点分离，或者进行双向电泳，一般使用SDSPAGE。之后进行转膜，将蛋白从胶上转移到膜上，以利于抗体杂交，之后加入抗体进行孵育杂交，之后洗掉没有结合的抗体，就可以进行显色反应了，显色反应很多，有化学发光、荧光等等。其实说白了就是让你能检测到你加入的抗体都在哪里。之后你就可以确认你的样品里有没有该蛋白，相对的量是多少。要是想要确定绝对的量就要使用ELISA 了。
2、WB实验中显影的原理，以及为什么PVDF膜上的样点可以转到X相片上
转膜用的是PDF膜，测的蛋白SOD大约kd，一抗抗兔(1：)要显红色你是在一张膜上同时杂了SOD和actin的抗体? 很简单，是组织特异性的
3、做western blot时最后显色用的是什么试剂，原理是什么
DAB显色液。 DAB被氧化显色形成褐色颗粒，即是显色。
4、做western blot,求显影定影液配方及定显影方法。
显影 定影液可以从购买显影和定影粉，加水溶解就可以了，我去过几个实验室都这样做的。 要在不透光的暗室操作，不过可以用红外灯来照明。(用紫外也可以..冏..) 把膜从TBST中拿出来后，在纸巾上吸干液体，加上发光液。 如果在关掉红外灯后，看得到发光的条带，则用X夹片机压片几秒钟(也可适当延长压片时间，自己实验一下就知道了)后，放在显影液里显影，直到看到黑色条带，在水中洗一遍，放到定影液中定影就可以了。 如果看不到发光的条带，则可以压多点时间，有些人还压片一两个小时，甚至是压片过夜。 在压片的时候，膜要用保鲜膜包住，在放上底片。底片和膜不能直接接触，不然就不出东西了。 详细资料请参考：on???
5、western blot的实验原理(详细的)
蛋白免疫印迹(Western blotting 或 Immunoblotting)一般由凝胶电泳、样品的印迹和 免疫学检测三个部分组成。 第一步是做 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。 第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上， 用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC 膜)和 PDF 膜， 蛋白转移的方法多用电泳转移 (转移电泳) ，它又有半干法和湿法之分，现在大多用湿法。 第三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂交结合后，再用酶标的第二抗体(碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗第一抗体的抗体)杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或 X 光底片上暴光的条带来显示抗原的存在。该技术被广泛应用于蛋白表达水平的检测中。 Western Blot与Southern印迹杂交或Northern印迹杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品(跑PAGE 胶的原理你懂吧~~~)，转移到固相载体(硝酸纤维素膜NC膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变(这个过程就是转膜)。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
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