发布时间:2023-03-14 16:18:00

  PCR实验代测,PCR实验设计,PCR实验-安徽华远

  多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是美国 Perkin-Elmer/Cetus公司人类遗传研究室Mullis K. B.等人于1985年发明的一种快速体外DNA片段扩增技术,是八十年代分子生物学资源领域的一项革命性突破,被誉为分子生物学资源发展史上的又一里程碑。该技术一问世,就在分子生物学、医学、生物工程、法医学、考古学等领域得到快速而广泛的应用,并且对已建立的基因克隆、DNA序列分析等现代分子生物学技术的发展也起了巨大的推动作用。

  PCR技术是一种模拟自然DNA复制过程的体外酶促合成特异性核酸片段技术(亦称无细胞分子克隆技术)。它以待扩增的两条DNA链为模板,由一对人工合成的寡核苷酸作为介导,通过DNA聚合酶促反应,在体外进行特异DNA序列扩增。其过程包括模板变性(denature)、引物退火(annealing)和用DNA聚合酶延伸(clongation)退火引物在内的重复循环系列,使末端被引物5’端限定的特异性片段成指数形式累积。由于在每一循环中合成的引物延伸产物可作为下一循环中的模板,因而每次循环中靶DNA的拷贝数几乎呈几何级数增长。因此20次PCR循环将产生约一百万倍(220)的扩增产物,具有操作简单、快速、灵敏度高、特异性强的特点,并且具有从DNA粗制品和降解的 DNA模板中扩增靶序列的能力,这一点在生药鉴定应用中尤为重要。

  PCR的原理类似于DNA的天然复制过程,关键是运用两个起始引物,分别为待扩增序列的相对的两条单链DNA结合,结合位点分别位于待扩增序列的两端,并且3’端相对,然后利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性,模仿体内的复制,在两个引物之间诱发聚合酶反应。PCR反应可以简述如下:

  在微量离心管中加入适量缓冲液,加微量模板DNA,四种脱氧单核苷酸(dNTP),耐热Taq聚合酶及两个合成DNA引物,并有Mg2+存在。

  1、加热使模板DNA在高温下(95℃左右)变性,双链DNA解开而变成单链DNA游离于溶液中。这是所谓变性阶段。

  2、PCR的引物是两段人工合成的寡核苷酸链,长度为16-24个核苷酸残基,其顺序由被扩增的DNA片段两端的序列决定。这两段寡核苷酸 链分别与模板DNA的正链和负链互补,所互补的位点一个在被扩增序列的“上游”,一个在被扩增序列的“下游”。高温使模板DNA变性成单 链以后,温度降低,由于PCR反应体系中引物的拷贝数远远多于模板DNA的拷贝数,因而引物与模板 DNA形成复合物的机率要大大高于 模板DNA两条单链的重新结合。只要严格地控制复性的条件,复性过程是倾向于形成引物与模板的复合物的。这是退火阶段。

  3、溶液反应温度升至中温(72℃),在Taq酶作用下,以dNTP为原料,引物为复制起点,模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两 条双链。这是延伸阶段。

  如此重复,改变反应温度,即高温变性,低温退火,中温延伸三个阶段。这三次改变温度为一个循环。每循环一次,使特异区段基因拷贝数扩大一倍,一般30次循环,基因放大数可达2n倍。可用公式

  Y=(1+X)n

  表示,式中Y=DNA扩增倍数,X=扩增效率,循环数为n。

  如X=100%,n=20时,Y=1048576倍。但实际扩增效率(X)不会达到 100%。

  2 试验条件

  本程序适用于自动PCR操作,可适用于大多数情况,所用酶是不含核酸外切酶活性的热稳定聚合酶,如Taq聚合酶等。

  引物(各50pmol)

  0.2mmol/L dNTPs(必须使用高质量的dNTPs,这一点非常重要。dNTPs经反复化冻后会发生降解,因此应分成小份保存。应注意混合物中四种dNTP的量要相等)

  模板DNA:约0.05~1mg基因组DNA或0.002~0.02mg质粒DNA

  Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut)

  10×PCR缓冲液(500mmol/L KCl,15mmol /L MgCl2,100mmol/L Tris·HCl,pH 8.3)

  矿物油

  电泳所需试剂

  【仪器设备】

  PCR扩增仪

  电泳装置

  微量离心机

  微量移液器(1~20ml和20~200ml)

  0.5ml Eppendorf 管

  紫外线观察装置及照相设备

  2.2.2.3 操作程序

  1.在无菌的Eppendorf管内加入以下反应物:

  

 

  2.93℃ 反应2 min后开始以下循环:

  93℃变性反应1 min;

  50℃退火反应1 min;

  72℃延伸反应3 min。

  经过17~35循环后,最后一个循环72℃增加5 min。循环结束后反应产物置于40℃保存。

  3.取1~5ml反应产物走凝胶电泳,经溴化乙锭染色检测扩增的情况。

  2.2.2.4 应注意的问题及其解决方法

  1.PCR反应条件的优化

  要优化特定的PCR反应,有必要试用不同的反应组分和循环参数。表2-1列出了添加或改变某一试剂浓度对反应结果的影响,从中大家可以得到一些线索以改进反应条件,提高PCR产量和/或特异性,一般情况下,只须改变一两个参数就行了,如pH值和MgCl2浓度。表2-2给出了循环参数对PCR结果的影响。

  表2-1 PCR各反应组分浓度对产物特异性和产量的影响

  反应组分提高产量提高特异性

  模板浓度增加减少

  引物浓度高至75 pmol低至15 pmol

  引物长度-增加

  dNTPs各1 mmol/L各20 mmol/L

  Tris-HCl (10 mmol/L pH8)pH高至10*pH高至10*

  MgCl2高至4 mmol/L1.5 mmol/L

  DMSO-10%**

  甘油-2%

  甲酰胺-5%

  Taq DNA聚合酶***高至5U0.5U

  效果可能不可预测

  添加10% DMSO时,Taq DNA聚合酶的活性会被抑制47%,因此反应加大Taq DNA聚合酶的用量(即5U)予以补偿

  Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut

  表2-2 可改变以提高PCR产物的特异性和/或产量的循环参数

  反应条件提高产量提高特异性

  循环数最多35个减至25个

  变性*增至1 min-

  引物退火**降至45℃升至72℃

  引物延伸***在后期循环中延长维持30s

  使用基因组DNA作模板时,开始几个循环变性应于97℃进行

  假定Tm值为60℃

  延伸时间依产物大小而定:1000bp的产物延伸30s即可,产物更长时,按每1000 bp延伸0.5 min计,在后期循环中增加延伸时间可以提高扩增效率

  2.引物的设计

  毫无疑问,引物的碱基组成,长度及其靶序列的同源性是决定PCR成败的首要因素,选择设计引物在一定程度上仍然要靠经验,对于某一对引物而言尚无通用的规则可严,但应遵守以下原则:

  (1)一般性原则:

  ①长度:15~30bp,其有效长度 [Ln=2 (G+C)+(A+T)] 一般不大于38,否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74℃),从而降低产物的特异性。

  ②G+C含量:应在45%~55%之间,PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5~10度。引物长度小于20时,其Tm值等于4×(G+C)+2×(A+T)。

  ③ 碱基分布的随机性:应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现3个的连续的G或C,否则会使引物在G+C富集序列区错误引发。

  ④ 引物自身:不能含有自身互补序列,否则会形成发夹样二级结构。

  ⑤引物之间:两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基,不然会形成引物二聚体,尤应避免3’端的互补重叠。

  ⑥特异性:与非特异扩增序列的同源性应小于70%,或少于连续8个的互补碱基。

  (2)引物的3’端:

  引物的3’端很大程度上影响Taq酶的延伸效应,除特殊情况(AS-PCR)外,3’端不应发生错配。S. Kwok等发现,引物的3’端发生错配时,A:A使产量下降至1/20,A:G或C:C下降至1/100。当末位碱基是T时,即使错配也能引发链的合成,而为A时错配的引发效率最低,G、C居间。

  因此,引物的3’端碱基最好选用A、G、C,而尽可能地避免选用T,尤应避免连续出现2个以上的T。

  此外,如果扩增编码区域,引物的3’端不要终止于密码子的第3位,因此处易发生简并,从而影响扩增特异性。

  (3)避开引物的二级结构区:

  某些引物无效的原因是引物重复区二级结构的影响,因此选择扩增片段时应注意避开二级结构区,有些计算机软件可帮助确定该区域,如不能避开,则可用7- deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP,有助于PCR成功。

  目前在引物选择中已广泛应用计算机软件,从EMBL或Genebank中查找有关基因序列,并依据上述原则对所选用引物进行评价。

  3.出现异常结果时的解决思路

  在做PCR反应的过程中,由于其酶促反应的本质,影响最终结果的因素较多,所以出现一些非预料的结果是可以理解的。下面简单地总结一下在PCR反应结果出现异常时我们应该采取的措施。

  (1)电泳检查没有 PCR产物

  a.需检查一下Taq DNA聚合酶是否失活,或是活性太低,还需查一下在加样过程中是否向体系中加过Taq DNA聚合酶;

  b.需检查一下所使用的引物,看其序列设计是否正确,是否碱基组成不平衡;

  c.需要检查一下PCR反应过程中模板是否变性充分,尤其在前几个循环中是否变性充分;可以适当地提高模板变性的温度或是适当延长变性的时间;

  d.需检查一下在PCR反应体系中是否有Taq DNA聚合酶的抑制剂,如SDS污染等等;

  e.需检查一下模板中是否有蛋白酶和核酸酶的污染,可以预先加热使之失活。

  (2)电泳检查出现引物二聚体区带

  a.需检查一下两个引物的3’端是否互补,或者是否有相类似的回文结构;

  b.需检查一下使用的引物是否太短,可以予以适当的延长;

  c.需检查模板的用量,模板以10-4个拷贝为最佳,模板太少会造成引物相对过量;

  d.适当地降低引物的浓度,引物浓度过高是出现引物二聚体的最主要原因;

  e.循环次数太多也易形成引物二聚体,可以适当地减少循环数;

  f.可以将复性温度提高一些以减少引物二聚体形成。

  (3)电泳检测PCR产物呈片状(smear)

  a.需检查一下Taq DNA聚合酶的用量,适当地减少Taq酶的量有助于特异性条带扩增;

  b.可以提高反应的退火温度,或者直接采用两个温度的PCR(68℃退火和延伸,94℃模板变性);

  c.适当地降低Mg2+的浓度也可起到降低非特异性扩增可能性的作用;

  d.适当地减少反应退火的时间和延伸的时间;

  e.适当地减少循环次数也会有效果;

  f.可以尝试使用巢式引物PCR(nested primer PCR)。

  (4)电泳检测PCR产物出现其它非特异性条带

  a.需检查一下引物的3’端是否有连续排列的G或C;

  b.可以适当地提高退火温度或直接采用两步温度PCR方法进行扩增;

  c.可以降低Taq DNA聚合酶的用量,同时也降低引物的浓度;

  d.可以适当地减少退火所用的时间以及延伸反应的时间;

  e.可以适当地增加或减少一些Mg2+浓度。

  4.假阳性

  实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果,提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。造成假阳性的原因包括样品污染、扩增试剂污染、扩增产物交叉污染等。常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操作中形成的喷雾、DNA抽提仪器、试剂及任何与扩增产物接触的东西。

  预防各种污染的措施主要有:(1)工作区隔离。(2)改进实验操作,如在加样过程中避免试剂飞溅、吸头离心管使用前高压处理、试剂分装成小份一次使用后弃去等。(3)操作程序合理化,如后加阳性对照等。

  交叉污染的处理方法包括:(1)在DNA模板和多聚酶加入前,紫外线照射反应管内容物以破坏污染的PCR产物。一般选用波长254nm照射30min(Nature, 1990, 34:27)。(2)PCR实验中使用dUTP,而不用dTTP。在扩增前使用UraciⅠN-glycosylase(尿嘧啶糖基化酶)处理可降解交叉污染的PCR产物,而不降解基因组DNA模板,然后热灭活此酶,再进行扩增反应(Gene, 1990, 93: 125)。美国PE公司提供此类试剂盒(PCR carry-over preventionkit)。(3)在PCR反应前加入一种光化学试剂,反应完成后激活该试剂,光化学试剂可交联 DNA链,使之不能再扩增(Nucleic Acids Res, 1991, 19: 99)。

  2.2.2.5 PCR技术在分子生药学中的应用

  对于生药学家来说,PCR技术已称为他们研究生药的一种崭新而有力的工具。PCR技术在生药学中的应用主要有两方面:①扩增和直接测序或者对属性特异的DNA序列定性以用于系统发育或亲缘关系的分析,也可用于鉴定品种;②通过简单纯化从复杂生物样品的混合物中鉴定病原体和土壤微生物,用于药用植物的基因工程。

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