华远新闻——蛋白质组实验流程的样品制备原则

　　样品制备是双向电泳中zui关键的一步，将直接影响2-DE结果好坏。目前并没有一个通用的样品制备方法，尽管处理方法多种多样，但都遵循几个基本的原则：1)尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提zui大量的总蛋白，减少蛋白质的损失;2)减少对蛋白质的人为修饰;3)破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于*变性状态。

　　根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes),主要包括尿素(Urea)和硫脲(thiourea);表面活性剂(sufactants)，也称去垢剂，如CHAPS与Zwittergent系列等双性离子去垢剂;还原剂(reducingagents)，zui常用的是二硫苏糖醇(DTT)和磷酸三丁酯(TBP)等。当然，也可以选择性的加入Tris-base,蛋白酶抑制剂以及核酸酶。

　　样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的zui大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和2DE重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏IPG胶条，这样都会造成2-DE的失败。样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。

　　核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫;而加入的外源核酸酶则会出现在zui终的2D胶上。脂类和多糖都可以通过超速离心除去。透析可以降低盐浓度，但时间太长;也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。

　　因此，样品制备方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求来进行选择。目前有很多方法适于2-DE，如组织或细胞的总蛋白提取物、亚细胞组份或细胞器蛋白、免疫沉淀的蛋白及其它亚组份蛋白(如磷酸化蛋白、采用亲合纯化凝集素结合蛋白等)。

　　一、细胞样品

　　1.细胞培养，加药与处理。

　　2.胰酶消化贴壁细胞，PBS漂洗3次(1500g，5min)，弃上清,再次离心，去尽残液(非常重要!)。如要比较细胞膜蛋白组的差别，用细胞刮收获细胞。如用10mMTris/250mMSucrose(pH7.0)代替PBS，可有效降低样品的盐浓度。

　　加入5倍体积裂解液，混匀(或将1×106细胞悬于60～100µl裂解液中)。

　　3.加50ug/mlRNase及200ug/mlDnase，在4℃放置15分钟。

　　4.15,000转，4℃离心60分钟(或40,000转，4℃离心30分钟)。

　　5.收集上清。

　　6.测定蛋白浓度(采用BioRadRC/DCproteinassaykit)。

　　7.分装样品，冻存于-70℃。

　　二、组织样品

　　1.碾钵碾磨组织，碾至粉末状。

　　2.将适量粉末状组织转移至匀浆器，加入适量裂解液，进行匀浆。

　　3.加50ug/mlRNase及200ug/mlDNase，在4℃放置15分钟。

　　4.15,000转，4℃离心60分钟(或40,000转，4℃离心30分钟)。

　　5.收集上清，测定蛋白浓度。

　　6.分装样品，冻存于-70℃。

　　注意事项：

　　1.8mmol/LPMSF必须在添加还原剂之前用，否則PMSF会失去活性。

　　2.40mmol/L浓度以下的Tris可使有些蛋白酶在高pH值下失活。

　　3.细胞清洗――大多用PBS，若PBS残留于细胞表面会造成胶上出现水平条纹，则可利用(10mmol/LTris,250mmol/LsucrosepH7.0)來解決此问题。

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