发布时间:2023-03-21 15:01:00

  华远新闻:实验室革兰氏染色培养基配制方法

 

  革兰氏染色法,是指细菌学中广泛使用的一种重要的鉴别染色法,属于复染法。这种染色法是由丹麦医生革兰于1884年所发明,最初是用来鉴别肺炎球菌与克雷伯肺炎菌。

  革兰染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤。未经染色的细菌,由于其与周围环境折光率差别甚小,故在显微镜下极难区别。经染色后,阳性菌呈紫色,阴性菌呈红色,可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征,从而用以分类鉴定。染色原理:通过结晶紫初染和碘液媒染后,在细菌细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物,再用95%乙醇脱色。

  革兰氏染色液用水:培养基制备用水应使用电阻率不小于30万Ωcm的蒸馏水或与其同质的水,不使用离子交换器生产的去离子水。

  称量:称量时需用多功能的角匙,预防交叉污染而影响检验结果;干粉培养基易吸潮,如有条件,尽量在湿度较低的房间称取培养基。

  复水:复水时不可用铜锅或铁锅,防止有离子渗入培养基中,影响微生物的生长;容器的大小需大于复水后培养基总体积的2倍以上,避免在加热溶解过程中,培养基溢出;含有琼脂粉的培养基,在加热溶解之前可以浸泡数分钟;加热培养基时一定要进行搅拌,特别是琼脂类培养基。

  为避免烧焦和沸腾溢出,对于少量的培养基使用沸水浴进行加热。烧糊的培养基营养物质被破坏,并可产生有毒物质,如发现焦化,或未溶解均匀前培养基有溢出,该培养基即不能使用,应重新制备。

  灭菌:通常培养基采用湿热灭菌,即高压蒸汽灭菌,通常是121℃ 15 min,含糖或特殊培养基,按照国家标准或生产商提供的说明灭菌。已配制好的培养基必须立即灭菌,预防微生物生长繁殖而耗费养分,改变培养基的酸碱度。

  高温可破坏培养基的营养成分,还会使琼脂的凝胶强度下降,因此必须严格控制灭菌温度和时间,并且不可重复灭菌。高压蒸汽灭菌锅的压力表等要定期进行检定,并定期采用生物指示菌法或化学变色纸片对灭菌效果进行验证。

  pH测定:细菌必须在适宜的pH范围内能够正常生长繁殖或体现其生物特性。培养基配方要求的pH为灭菌或消毒后的pH 值,即培养基使用前的pH,并应在25℃温度下选用精密酸度计进行测量,固体琼脂培养基应以特殊的胶体表面测量电极进行测量。应用过程中,如果需要调整培养基的pH,应用1mol/L Na0H或 lmol/L HCL调整,留意不可反复调pH,否则会影响培养基的渗透压。

  配置好的培养基保存:灭菌以后培养基应该迅速冷却至所需温度,避免长时间保存在灭菌锅内,导致过度灭菌,影响培养基的营养成分或选择性效果。所配制的培养基的量,应该是在最长保存期限内正好使用完。含染料的培养基应闭光保存;倒好的琼脂平板如果配制的当天未使用完,应当冷藏保存,如果保存时间超过2天,应将其放入密封的塑料袋中保存。

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