华远试剂——蛋白质结构解析的方法

　　到目前为止，蛋白质结构解析的方法主要是两种，x射线衍射和NMR。近年来还出现了一种新的方法，叫做Electron Microscopy。其中X射线的方法产生的更早，也更加的成熟，解析的数量也更多，我们知道，个解析的蛋白的结构，就是用x晶体衍射的方法解析的。而NMR方法则是在90年代才成熟并发展起来的。这两种方法各有优点和缺点。

　　这两种方法的一般的步骤和各自的优点和缺点。电子显微镜(electron microscopy)作为一种新型的技术，目前的应用还是非常少，并且比较狭窄，我可能等到zui后在给它作些介绍，而且相信绝大多数人也没有听说过，也不会有很大的兴趣。

　　1.首先是X晶体衍射。首先要得到蛋白质的晶体。

　　通常，都是将表达蛋白的基因PCR之后克隆到一种表达载体中，然后在大肠杆菌中诱导表达，提纯之后摸索结晶条件，等拿到晶体之后，工作便完成的80%，将晶体进行x射线衍射，收集衍射图谱，通过一系列的计算，很快就能得到蛋白质的原子结构。

　　用射线的优点是：速度快，通常只要拿到晶体，甚至当天就能得到结构，另外不受大小限制，无论是多大的蛋白，或者复合体，无论是蛋白质还是RNA、DNA，还是结合了什么小分子，只要能够结晶就能够得到其原子结构。所以x射线方法解析蛋白的瓶颈是摸索蛋白结晶的条件。这个时候运气就显的特别重要。关于这个有好多有趣的离子。据说国外一个同学在摸索两个月无果之后，毅然去度假，就将蛋白扔在一个很随便的地方，等度假回来之后，却发现已经结晶了。

　　2.NMR(nuclear magnetic resonance)现象早已发现了很久，然后将这种方法用来解析蛋白结构，却是近一二十年的事情。不过到今天为止，用nmr方法来解析结构已经十非常成熟的方法。

　　原理暂且放在一边，先说常规步骤。

　　首先通过基因工程的方法，表达出目的蛋白，提纯之后，摸索一下蛋白稳定的条件，如果蛋白没有聚合，而且折叠良好，便将蛋白样品(通常是1mM-3mM，500ul，Ph6-7的PBS)装入核磁管中，放入核磁谱仪中，然后用一系列写好的程序控制谱仪，发出一系列的电磁波，激发蛋白中的H、N13、C13原子，等电磁波发射完毕，在收集受激发的原子所放出的“能量”，其实也是小磁场，通过收集数据、谱图处理、电脑计算从而得到蛋白的原子结构。

　　它的优点就是，蛋白在液体中得到结构，是一个动态的结构，事实上所有在pdb中或者文献中发表的NMR结构都是十个或者二十个结构的ensemble(集合)，这就是因为这些结构都是进行能量优化后符合条件的结构，或者说就是溶液中的蛋白结构。因为是动态就很容易的研究蛋白与其他蛋白或者配基的相互作用。缺点是，受大小的限制，到目前为止NMR解析蛋白结构的上限是50kd。

　　无论是晶体还是NMR，蛋白都要符合下面的条件：首先表达量要大，象NMR要求1个mM500UL，这就要求十几个毫克，结晶要摸索很多的条件也需要大量的蛋白。所以蛋白一定要在胞质中表达才行。其次，蛋白要折叠。我们知道许多蛋白，尤其是真核蛋白在大肠杆菌中是以包含体的形式存在，这种情况下是不行的，除非复性。如果你的蛋白在胞质中表达，如果你不确定是不是表达，可以从分子筛上的位置，或者扫CD确定一下，当然zui简单的是做一个NMR一维谱，只需要几分钟。

　　小于20Kd的蛋白可以考虑NMR，因为NMR研究功能核相互作用方面是更加擅长的，而且不需要结晶，现在速度也不慢。如果比较大，可以考虑晶体解析。

　　对于用NMR来解析结构，zui重要的条件就是非常昂贵的核磁谱仪，以及同位素标记蛋白。只要采集了谱之后就算的得到了原始数据，其他的在电脑上通过专业的软件处理就可以了。对于小分子蛋白不需要同位素标记，也不需要600、800MHz的谱仪，一般的400、500MHz的小型谱仪也可以做了，但是对于10K以上的蛋白，基本上就要用磁场更强的600、800Mhz的核磁谱仪。

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