华远试剂：流式细胞术实验处理样本步骤

　　流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)能够快速测定细胞悬液中单个细胞的生物学性质，并可以对特定的细胞进行分选收集。广泛用于细胞生物学，免疫学，遗传学，基础医学等领域。接下来的 Protocol 中以小鼠的淋巴细胞为例进行细胞表面和胞内染色。

　　一. 试剂准备(远慕提供各种实验试剂)

　　Wash Buffer：PBS+1% FBS

　　破膜剂(ICS)：用双蒸水配置 10 % Saponin(Sigma)。

　　破膜固定剂：将配好的 ICS 用 4% 多聚甲醛稀释 100 倍

　　ICS Wash Buffer：将配好的 ICS 用 Wash Buffer 稀释 100 倍。

　　二. 细胞表面染色

　　收集各组细胞，进行细胞计数，加入适量 Wash Buffer 液洗涤，1500 rpm 离心 5 min，去上清，加入 50 μl Wash Buffer 重悬。

　　(可选)Live dead 染色，每管加 0.1 μL Zombie GreenTM Dye(样品多时使用时可先稀释)，震荡混匀，室温避光孵育 10～15 min。Wash Buffer 液洗涤，1 500 rpm 离心 5 min，弃上清。

　　封闭 Fc 受体：每管中加入 1 μg/106 细胞 Anti-Mouse CD16/CD32 抗体封闭荧光抗体 Fc 受体引起的非特异性染色。震荡混匀，4℃ 孵育 30 min(或室温避光 15 min)。Wash Buffer 液洗涤，1 500 rpm，离心 5 min，弃上清。

　　用适量体积 Wash Buffer 液重悬每个样本，将各组细胞等细胞数混合后分装到单染管和不染抗体管，作为流式检测时调节电压。

　　单染管中加入相应表面染色抗体，同时在每个样本中加入 1 μL percp CD3/106 细胞和 0.5 μL PE CD4/106 细胞，震荡混匀，4℃ 避光孵育 30 min(或室温避光 15 min)。

　　用 Wash Buffer 液洗涤，1500 rpm 离心 5 min，弃上清。

　　打孔或者加入 200 μL 1% PFA(多聚甲醛)固定过夜。

　　三. 胞内染色

　　将全部管细胞固定打孔。每管加入 150 μL 固定破膜剂，震荡混匀，4℃ 避光孵育 20 min。

　　ICS Wash Buffer 液洗涤，用法同 Wash Buffer 液。

　　在相应的需要进行胞内染色的样本中加入适当量胞内染色抗体(如 APC IFN-γ抗体)，4℃ 孵育 30 min 或室温避光孵育 15 min。ICS Wash Buffe 液洗涤，1 500 rpm 离心 5 min。

　　弃离心上清液，根据实际情况加入 200 μL 或者 300 μL Wash Buffer 液重悬。

　　震荡混匀，流式上机。

　　四. 注意事项

　　每一步离心倒掉上清时可以先在实验台上铺几层平板纸，倾倒上清后可吸掉管口的液体。

　　为了避免打孔剂对细胞形态的影响从而影响后续圈门影响实验结果，所以不管是否需要胞内染色，每个样本都需要打孔。

　　染色时抗体的加入量可根据实际情况调整，为避免抗体浓度对染色的影响，样品染色体系不得大于 100 μL。为减少染色时加样的误差，可配置表面染色抗体稀释液，双染或多色染色可把多种抗体稀释到一管中。按 10 μL 或 5 μL 体系，用 Wash Buffer 液稀释。

　　为了避免游离抗体的结合出现假阳性，可洗涤两次。

　　检测的细胞量不能过少也不能过多，细胞太少检测时样本流量会增大影响变异系数，细胞过多，可能会导致抗体或染料相对不足，影响实验结果。

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