发布时间:2023-03-28 14:35:00

  华远实验总结——重组蛋白促溶标签特点及选择

 

  重组蛋白表达在现代生物学技术发展中起着重要的推动作用。通过利用宿主实现外源性蛋白表达,为一些重要蛋白尤其是人源蛋白的结构和功能研究的提供了强有力的工具。为了能够进行后续的结构功能研究,所获得的重组蛋白必须可溶,稳定,正确折叠以及具有生物活性。

  然而,实际研究中,这些往往成为获得一个理想重组蛋白的障碍。重组蛋白表达的可溶性成为首要解决的问题。因此,许多融合标签被引入。本文介绍下常用的促溶标签特点以及选择,希望对大家实验中遇到的重组蛋白溶解性问题有所帮助。

  常用促溶标签特点

  01 麦芽糖结合蛋白

  麦芽糖结合蛋白(Maltose binding protein,MBP)是大肠杆菌K12品系中的一个自由蛋白,由malE基因编码,分子量为42kDa,属于大肠杆菌吸收和分解麦芽糖通路的一员。

  MBP标签-出色的特点是它强大的促溶能力。主要表现在两方面:促溶范围广,促溶效率高。MBP标签得到广泛应用的另一个重要原因是它能够通过标签和直链淀粉特异结合并在10mmol/L麦芽糖非变性条件下洗脱,从而实现单极纯化。另外,将MBP融合在N端或C端都具有促溶作用。目前已经有商业化的MBP融合标签载体来适应研究需要。

  02 谷胱甘肽巯基转移酶

  谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione S- transferase, GST), 初被发现于日本血吸虫,蛋白大小26kDa,是一个常用的可溶性亲和纯化标签。

  GST-突出的优点是它能够与固定的谷胱甘肽产生亲和力,在10mmol/L还原型谷胱甘肽的非变性条件下洗脱,终达到亲和纯化目的。GST对重组蛋白还有另一个有利作用,就是减少宿主内到那边的降解,增加蛋白稳定性。但是有报道指出GST的促溶效果并不十分明显。

  03 硫氧还蛋白

  硫氧还蛋白(Thioredoxins)是一系列广泛存在于生物体内的氧化还原酶,它能通过置换硫代二硫化物来减少二硫键的结合。常用作融合表达标签的硫氧还蛋白A(TrxA), 分量为11.6kDa,来源于大肠杆菌。

  TrxA标签*的优点是它的热稳定性。TrxA本身不作为亲和标签来进行重组蛋白优化,而是通过在高温条件下将杂蛋白变性去除而重组蛋白得以保存。TrxA也具有*的促溶效率,用作促溶标签时可将重组蛋白的可溶性表达从12%提高至95%。

  04 小泛素样修饰蛋白

  小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-related modifier,SUMO)在真核生物中极为普遍存在,而原核生物中未曾发现。常用作融合标签的SUMO来源于啤酒酵母,分子量11.5kDa。

  SUMO标签大的特点是能够被SUMO蛋白酶特异识别并高效降解,使得后续标签移除过程准确高效。SUMO标签不仅能够加强重组蛋白的可溶性,也能提高其表达量。

  由于真核细胞内存在内源性SUMO蛋白酶,所以野生型SUMO标签不能在真核表达体系中应用。LifeSensors公司已经开发出工程改造的SUMO标签及配套的特异性蛋白酶,使得SUMO标签可以适用于酵母,昆虫细胞和哺乳动物细胞等真核表达体系。

  05 NusA标签

  NusA蛋白(N-utilization substance A)是大肠杆菌中一类转录延长的抗终止因子,分子量约55kDa。

  由于NusA有着促进DNA转录和减缓翻译的生物活性,使得表达出来的蛋白有更多时间进行折叠,能让重组蛋白得到稳定和有活性的表达,即使不移除NusA标签,融合蛋白依旧能存在活性。

  06 其他促溶标签

  有很多促溶标签因其自身特有的性质,常用作有某种特定性质的目的蛋白融合表达。例如,来源于大肠杆菌的I型蛋白质二硫键异构酶DsbA具有高度亲水性,能够促进蛋白的可溶性表达。而且由于DsbA可以利用它具有的信号肽从细胞质向细胞周质间隙运输,可以利用这个标签进行蛋白分泌表达。砷-酸盐氧化还原酶(ArsC)可以促进有聚集倾向的外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达。

  促溶标签新的研究进展

  串联标签的使用

  膜蛋白的可溶性表达

  常用促溶标签的新衍生物

  新促溶标签的发现

  1.串联标签的使用

  TrxA, SUMO, NusA等这些促溶标签本身不能用于亲和纯化,所以需要和其他的亲和标签串联使用来对融合蛋白进行纯化,-常见的亲和标签为多聚组氨酸标签(his-tag)。

  有些重组蛋白纯化后,需要将标签蛋白去除,终获得目的蛋白进行后续结果和功能研究。常见做法是在标签蛋白和目的蛋白之前加入特定序列的多肽作为标签移除蛋白酶的识别位点,如肠激酶,Xa因子,TEV以及凝血酶(thrombin)等。这些蛋白酶将标签蛋白切除后,会在目的蛋白N端留下氨基酸残基,而SUMO标签的蛋白酶能够特异识别SUMO的三级结构并在其C端Gly-Gly序列后进行切除,通过这个方法能获得具有天然N段的目的蛋白。

  不同标签联合使用能产生不同的效果,这需要根据研究需求和目的蛋白特性来进行灵活组合,有研究者利用GFP绿色荧光蛋白的荧光特性,将GFP标签和MBP标签以及亲和纯化标签HIS 三级串联,用古语表达肝素酶I(HepA), 该方法不仅获得了高纯度可溶HepA, 还可以对目的蛋白生产过程中的生物活性实时监控。

  2.膜蛋白的可溶性表

  膜蛋白存在于脂质的生物膜上,具有疏水性,而且重组表达时容易出现表达和错误折叠等情况,所以膜蛋白的重组表达有很多困难。我们可以在需要表达的膜蛋白上融合促溶标签得到可溶重组蛋白。有研究表明,MBP, Trx和SUMO等标签,可以增加膜蛋白的溶解性和表达量,尤其是小分子量的膜蛋白(10-20kDa)。

  3.常用促溶标签的新衍生物

  为了使常用促溶标签能满足更多的应用需求,可以对现有标签进行改造或者寻找标签蛋白的其他物质表达形式。比如为了解决GST融合蛋白寡聚后导致的纯化洗脱困难,可以用硫-甲基化谷胱甘肽替代谷胱甘肽提高洗脱效果。来源于热球菌属的MBP可以作为耐热标签来表达热稳定的重组蛋白。

  4.新促溶标签的发现

  一些新兴的促溶标签正在不断被发现和应用。比如某些在噬盐细菌中应用的促溶蛋白正在被研究,并有希望成为*的新型促溶标签。通过人工改造合成的多肽片段也可以作为促溶标签使用。

  标签选择

  在选择促溶标签的时候,应该充分考虑各种因素,如该标签是否可以用来亲和纯化,是否对目的蛋白空间结构和生物活性有影响,以及成本和技术路线简单快捷。在充分了解各标签的特点和自身需要的基础上做出合适选择。为了快速选择合适目的蛋白的促溶标签,目前比较可行的一个办法是在构建融合表达时,平行构建多个不同标签的促溶表达载体,根据表达纯化结果,进行重组蛋白的生产。

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