华远技术分享：凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析
TFAR19(PDCD5)是由本研究室在上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因,前期的功能研究表明,它是促进细胞凋亡的增强剂.利用荧光素(FITC)标记的TFAR19单克隆抗体为探针,对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发现,凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象,伴随着细胞核形态学的变化,持续较长时间,在凋亡小体中仍然可见.
同时我们发现,凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸(PS)外翻和细胞核DNA的片段化,提示TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一.进一步的研究证明,凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义,不同细胞凋亡早期均出现TFAR19高表达和核转位.这为研究细胞凋亡早期所发生的事件,提供了一种新的技术和指标.
(一)TFAR19蛋白的细胞定位分析
材料试剂:
FITC标记的单克隆抗体,pH7.4 、0.15Mol/L PBS,3%的多聚甲醛,PBS-T(pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20),胎牛血清,荧光细胞洗液:pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 .FACS管,Tip头,移液器.
仪器:低温水平离心机, 37°C水浴箱,荧光显微镜,共聚焦激光扫描显微镜,流式细胞计方法:
1 悬浮细胞的染色:
(1)收获正常和诱导凋亡的细胞(0.5~1′106),PBS洗2次,1000rpm′10min.
(2)3%多聚甲醛冰浴10min,PBS洗2次,1000rpm′10min.
(3)加入PBS-T溶液,37°C孵育15min,PBS洗2次,1000rpm′10min.
(4)加入200ml胎牛血清,室温反应30min.
(5)加入5ml FITC标记的TFAR19单抗(终浓度为1:40),4°C反应30min(6)荧光细胞洗液洗2次,1000rpm′10min.
结果观察:将细胞沉淀滴片,荧光显微镜及共聚焦激光显微镜下观察TFAR19在细胞中的定位.同时用流式细胞计定量检测TFAR19蛋白的平均荧光强度.[图12]
2:贴壁细胞的原位染色
(1) 贴壁生长的对数期细胞铺在24孔或6孔板中(内有洁净盖玻片),让其爬片生长,待长到50%~80%满时,凋亡诱导剂处理细胞.
(2) 将不同时间点处理的细胞进行免疫荧光染色,染色步骤同上.
(3) 将染色的爬片细胞放于一张滴有少量甘油(5ml)的载玻片上,荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜观察TFAR19在细胞中的定位.
凋亡相关蛋白TFAR19结果观察:
3:临床病理切片的染色、检测.
4:原代细胞的培养、检测.
5:分析TFAR19蛋白在人体内各组织器官的分布及定位(二)TFAR19蛋白的表达与临床疾病
1. ELISA法检测正常人和疾病状态下,以及疾病的不同时期,血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗体水平.
材料和试剂:
1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸盐Buffer
2. 洗涤液: pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 203. 封闭液: 3%BSA(用洗涤液配制)
4. 酶标抗体的稀释:用封闭液稀释
5. OPD底物Buffer:Na2HPO4.12H2O 1.84g
柠檬酸 0.51g
DDW 100ml
6. 显色液(现配现用):底物Buffer 10ml
OPD 2mg
30% H2O2 2ml
7. 终止液 2Mol/L H2SO48. 重组人TFAR19, HRP标记的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器,ELISAReader(OD490nm),洗板机
操作步骤：
1. 用包被Buffer稀释的重组人TFAR19(1mg/ml)包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C过夜(一般24h以上).
2. 洗涤Buffer洗板三次,加入封闭液,200 ml/well , 37°C孵育2h或4°C过夜.
3. 洗涤Buffer洗板三次,加入不同稀释度的病人血清(3个重复孔)100ml/well ,37°C孵育1h.设包被Buffer、洗涤Buffer 、封闭液为阴性对照.
4. 洗涤Buffer洗板三次,加入1:2500稀释的HRP标记的抗人IgG, 100ml/well,37°C孵育1h.
5. 洗涤Buffer洗板三次,加入显色液,100 ml/well,避光反应10~15min.
6. 加入H2SO4终止反应,50 ml/well.
7. ELISA Reader 读取OD490 光密度值,分析和比较病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗体的表达水平.
2. Western blot 分析原发性肿瘤细胞和正常细胞的TFAR19蛋白的表达水平.
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