华远技术分享：免疫印迹(Western blotting)实验原理、试剂和操作步骤

　　(一)原理

　　Western blot是一种在PVDF或硝酸纤维素(NC)膜上进行的抗原抗体反应。蛋白电泳后，将蛋白转移至膜上，再与特异性抗体孵育，洗去游离的抗体，然后和酶标记的二抗孵育，再进行底物显色。由于抗原抗体反应特异性好，亲合力高，Western blot检测的灵敏度较高，尤其是采用酶促增强化学发光的方法(ECL)后，检测的下限可达到pg水平。ECL是指酶催化底物发荧光，荧光可使X光片曝光。由于酶标记在二抗上，二抗与一抗结合，而一抗特异性结合在目的蛋白条带处，因此显影、定影后观察到的条带即为目的蛋白带。

　　(二)试剂和材料

　　1. PVDF膜或NC膜。

　　2.电泳缓冲液：25 mM Tris碱、250 mM甘氨酸、0.1%SDS。

　　3.转移缓冲液：实验所用的PVDF或NC膜不同，转移缓冲液也可能不同，因此请仔细参阅PVDF或NC膜说明书。

　　4.TBS(pH7.5)：6.05 g Tris碱(50mM)、8.76g NaCl(150mM)溶于800 ml双蒸水,用 HCl调 PH至7.5，补加水至1L。

　　5.TBST：TBS+0.1%(v/v)Tween 20。

　　6.封闭液：1%试剂盒中的封闭液，或5%脱脂奶粉，溶于TBS中。

　　7.解离液：100 mM 二巯基乙醇、2%SDS。

　　8.化学发光Western blot试剂盒：生产这类试剂盒的公司包括 Roche、Pierce、Amersham 等，试剂盒中一般包括酶标记二抗、发光波A和B。

　　(三)操作步骤

　　1. 灌制SDS-PAGE电泳胶，方法参见一般的分子生物学实验方法。

　　2. 取免疫沉淀最后所得的上清,上样，电泳。

　　3. 用电转移装置将蛋白转至PVDF或NC膜上。

　　4. 电转移完毕后，取出膜,用TBS洗涤1次。

　　5. 将膜放入封闭液 于室温封闭1 h, 或4℃封闭过夜。

　　6. 用封闭液稀释识别目的蛋白的抗体至1-10 ug/ml，与含有目的蛋白条带膜在室温作用1 h。

　　7. TBST洗膜4次,每次15 min。

　　8. 按试剂盒说明书稀释酶标记二抗,与膜于室温作用30min。

　　9. TBST洗膜4次，每次15 min。

　　10. 按试剂盒说明书混合发光液A和B，与膜作用1 min后进行X光片曝光。

　　11. X光片显影和定影后观察结果。

　　12. 如果结果不理想或要用相同的膜检测另一种靶蛋白，可将膜与解离液于50℃作用30 min，去除结合于膜上的抗体, TBST洗2次，封闭后可重新检测(即重复 6-11步)。

　　(四) 注意事项

　　1.用于 Western blot和免疫沉淀的抗体最好不同，否则将出现很多非特异性条带。

　　2. Western blot中，转移在膜上的蛋白处于变性状态，其空间结构被改变，因此那些识别空间表位的抗体不能用于Western blot检测。这种情况下，可将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用抗体进行免疫沉淀，得到的生物素化的目的蛋白可用酶标记亲和素进行Western blot检测。

　　3.化学发光法检测的敏感度很高，实验中取胶和膜必须带一次性手套。

　　4. 曝光、显影和定影需在暗室中进行，X光片用完后一定要收好，避免曝光。

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