华远技术总结：RNA酶保护试验(RPA)试剂制备、操作步骤
rna酶保护试验((RNase Protection Assay,RPA)即糖核酸酶保护实验(Ribonuclease protection assay，RPA)是近十年发展起来的一种全新的mRNA定量分析方法。华远技术小编在本文主要介绍了核糖核酸酶保护分析实验的从试剂准备到、操作步骤以及实验结果全部的操作流程，供大家分享。
试剂准备：
1. GACU POOL：取100mM atp、CTP、GTP各2.78μl、100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。
2. 杂交缓冲液
IPES 0.134g、0.5M EDTA(pH8.0)20μl、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。
3. RNAse消化液：5M NaCl 120μl、1M Tris-HCl(pH7.4) 20μl、0.5M EDTA(pH8.0)20μl、RNase A(10mg/ml) 8μl、RNase T1(250U/μl) 1μl，加DEPC H2O至2ml
二、操作步骤
1.反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的PCR产物为模板制备，本文介绍后者。
(1)设计含T7启动子的PCR引物
由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板，所以一对引物中的下游引物5’-端要含T7启动子序列:
T7启动子序列为：5’-TAATACGACTCACTATAGGG
引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度，具体设计时可考虑100-400bp长。最好采用巢式PCR，即先扩增出一较长的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性，如下图所示：
上游引物
下游引物Ⅱ T7 启动子序列
下游引物Ⅰ
(2)PCR
先用上游引物和下游引物Ⅰ进行PCR，再以PCR 产物为模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7进行二次PCR(具体操作参见PCR章节)。
(3)探针合成标记与纯化
在0.5ml 离心管中加入下列试剂：
RNasin (40U/μl) 0.5μl
GACU POOL GAC
(含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61μM) 2μl
[α-32P]UTP(10μCi/μl) 2.5μl
DTT (二硫苏糖醇，0.1M) 1μl
5×转录 buffer 2μl
模板(50ng/μl) 1μl
T7 RNA 聚合酶 (15U) 1μl
混合后，短暂离心，37OC保温1hr。
加入DNaseⅠ(10U/μl)1μl, 37OC 15min, 然后75 OC 10min以灭活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。
加入：饱和酚 50μl
氯仿 50μl
酵母tRNA(2μg/μl) 4μl
DEPC H2O 100μl
室温下充分混匀，离心10000g×2min。取上层液置另一0.5 ml离心管中，加入100μl氯仿，混匀，离心10000g×2min。将上层液转移至另一0.5ml 离心管中，再加入3M NaAc 10μl、预冷无水乙醇250μl，混匀后，-20OC静置30min。4OC离心13500g×10min。弃上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗涤，4OC离心13500g×2min, 弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入50μl杂交缓冲液溶解沉淀，4OC下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。(参见本节电泳步骤)。
2.杂交
(1) RNA提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为1μg/μl。
(2)取8μl RNA加入1-3μl探针(根据探针检测结果调整)于0.5ml 离心管中。
(2) 80OC保温2min，然后40-45OC下杂交12-18hr。
3. 消化
(1) 杂交管于37 OC保温15min，加入RNase消化液，37 OC保温30min。
(2) 加入10%SDS 10μl、10μg/μl蛋白酶K 20μl，混匀，37 OC保温10min。
(3) 加入65μl饱和酚和65μl氯仿，混匀，室温离心，10000g×2min。
(4) 转移上层液到另一0.5离心管中，加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl，再加入200μl异丙醇，混匀后，置-20OC 30min，4 OC离心,135000g×10min。
(5) 弃上清液，室温下挥发乙醇，加入5-8μl上样缓冲液溶解沉淀。
4、电泳与放射自显影
(1)配制凝胶：(50ml)
40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺(19：1) 6.25ml
5×TBE 10ml
尿素 24g
加H2O至50ml
溶解后加入25%过硫酸胺50μl，TEMED 50μl，混匀，注入电泳槽中，插入梳，待胶凝固。
(2)预电泳
以1×TBE为上下槽电泳缓冲液，加上电压后进行预电泳，如果用测序电泳装置，电压应达2000v以上，功率设定为100w，温度设为50 OC。待胶板温度达50 OC时，暂停电泳，准备加样。
(3)加样
将已溶解在加样缓冲液中的样品80 OC加热2min，立即加样到胶孔中，电泳1-2hr。(电泳条件同预电泳)。
(3) 电泳结束后，打开胶板，用滤纸取下胶，覆上一层保鲜膜，放置于暗盒中，暗室红光下，压上一张X片，盖上暗盒，-70OC曝光1-3天。暴光结束后，将X光片显影、定影、水洗、晾干。
上述操作为本人经验之谈，有问题的欢迎交流。
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